背景:唇腭裂是儿童头面部的首发先天性畸形,其中腭裂和腭裂伴发唇裂的患者占70%以上。国内流行病学资料显示,唇腭裂位居我国出生缺陷的前三位。腭裂患ㄦ吸吮进食、语音发育及呼吸功能均可出现障碍;并产生明显的面中部凹陷等畸形,严重影响患儿身心健康。大量研究提示其发病率的增加与环境污染密切相关。2,3,7,8四氯二苯二噁英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)是一种无色无味、毒性严重的脂溶性物质,易在生物体内积累,环境中的二噁英很难自然降解消除。随着当前城市汽车尾气排放等不断增多,TCDD在环境中日益增多,它可以通过污染土壤,再经食物链传递并富集于机体,导致畸形和癌症等发生,对人体健康造成严重危害。已有研究发现,TCDD与腭裂发生相关。虽然文献报道TCDD能诱发实验动物的腭裂,但是相关机制的深入研究目前尚无报道。因此,本课题拟通过TCDD诱发的腭裂模型,研究其致畸机制以及干预措施,为防治腭裂发生提供科学依据。目的:利用常见环境污染源2,3,7,8-四氯二苯二噁英(2,3,7,8- tetrachlorodibenzodioxin, TCDD)诱导C57BL/6孕鼠产生先天性腭裂胎鼠;检测正常和腭裂胎鼠腭突组织中的关键因子TGF-β3表达情况、TGF-β3第一外显子水平及整体甲基化水平改变;同时利用甲基化供体叶酸进行干预,以深入探讨腭裂发生过程中TGF-β3表达改变情况、DNA甲基化修饰的作用和机制,以及叶酸对腭裂的干预机制及有效剂量。方法:1.利用TCDD诱导建立小鼠先天性腭裂动物模型。在C57BL/6J孕鼠第12个妊娠日(gestational day,GD),实验组以TCDD(64μg/kg)灌胃,对照组以等量玉米油灌胃。GD18,统计胎鼠数及存活率;解剖胎鼠,观察腭部畸形发生情况。对孕鼠及胎鼠的各主要脏器进行组织学检查,并对胎鼠的腭突组织进行大体及超微结构观察。2.获取腭裂胎鼠的腭突组织,运用免疫组化、RT-PCR、western blot技术检测TGF-β3基因的表达的变化。3.对腭裂胎鼠的腭突组织整体甲基化水平进行研究,并对关键因子TGF-β3的第一外显子甲基化水平进行检测。4.观察叶酸对小鼠腭裂的预防作用。GD12,C57BL/6J孕鼠随机分为四组:正常对照组以玉米油灌胃,TCDD组以TCDD(64μg/kg)灌胃,叶酸组以叶酸(100 mg/kg)灌胃,TCDD+叶酸组以叶酸(100 mg/kg)及TCDD(64μg/kg)灌胃。GD18,统计胎鼠数及存活率,检查畸形发生情况,并留取腭裂胎鼠作组织学观察及免疫组化、western blot及MS-PCR检测。结果:1. TCDD成功诱导出小鼠先天性腭裂,实验组胎鼠腭裂发生率为100%。实验组胎鼠两侧腭突发育不全,体积较小,不能在腭突中线处融合形成腭板,发生腭裂;对照组胎鼠腭部未见异常,两侧腭突上抬后完全融合。腭中缝(midline epithelial seam,MES)完全封闭。腭间质细胞相互连接贯通形成完整的腭组织。实验组胎鼠腭裂发生率高于对照组(P<0.01)。2.免疫组化、Western-blot及RT-PCR均显示在实验组胎鼠腭突组织中, TGF-β3 mRNA与蛋白的表达显著高于正常对照组。3. MS-PCR提示实验组胎鼠腭突组织TGF-β3第一外显子甲基化水平较正常组降低, MSAP提示实验组胎鼠腭突组织整体甲基化水平较正常组降低。4.甲基化供体叶酸进行干预后,免疫组化及Western-blot提示叶酸会降低实验组胎鼠腭突TGF-β3的表达, MS-PCR提示叶酸会提高实验组胎鼠腭突TGF-β3第一外显子甲基化水平。结论: TCDD诱导小鼠先天性腭裂产生可能与其上调TGF-β3表达有关。其中实验组胎鼠腭突组织TGF-β3第一外显子甲基化水平降低及整体甲基化水平降低可能起重要作用。甲基化供体叶酸可通过影响TGF-β3第一外显子甲基化水平及整体甲基化水平进而影响TGF-β3的表达,最终有效干预腭裂发生。