论文部分内容阅读
目的:动脉硬化闭塞症(arteriosclerosis obliterans,ASO)已成为周围血管疾病中最常见的病种,严重危害人类健康。而血管平滑肌细胞的参与是ASO的重要病理?,但其具体的分子机制尚不完全清楚,因此对于ASO的早期诊断及治疗显得尤为迫切和必要。近年来,随着非蛋白机制和转录后机制研究的逐渐深入,多数学者将研究聚焦于探索MicroRNAs(miRNAs)与ASO之间的关系。在前期实验研究的基础上,我们通过miRNA芯片方法筛选,发现miR-4463在正常人群血浆与ASO患者之间存在显著性差异。基于以上筛选结果,我们运用RT-qPCR技术验证miR-4463在ASO患者和对照人群血浆中的表达水平,并进行临床分期比较。因此,本研究,我们主要探讨miR-4463对ASO疾病中的血管平滑肌细胞的调控作用。方法:我们利用经典造模剂氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)干预的实验条件模拟动脉硬化疾病发生,通过RT-qPCR检测miR-4463分别在ox-LDL干预条件下的血管平滑肌细胞与其在对照组细胞中的表达差异及mi R-4463在ASO患者和对照人群血浆中的表达差异。通过转染miR-4463 mimic和miR-4463 inhibitor调控miR-4463的表达,进一步通过周期实验、凋亡实验、迁移实验等检测调控miR-4463水平对血管平滑肌细胞功能产生的影响。根据功能试验结果,通过TargetScan预测miR-4463可能参与调节的靶基因及相关的下游通路,并选择JNK这一与细胞迁移及平滑肌细胞表型转换密切相关的通路作为进一步探究的对象。结果:通过mi RNA芯片方法筛选结果发现miR-4463在ASO患者血浆中的含量较对照的健康人群表达显著降低53%(P=0.0145),通过RT-qPCR发现miR-4463在oxLDL干预条件下的血管平滑肌细胞中的表达较正常对照组的表达下降75%(P=0.0024)。周期实验、凋亡实验、迁移实验等结果显示,发现转染miR-4463 mimic后与NC组相比迁移细胞数下降了57.5%(P<0.001),但mi R-4463 inhibitor组较NC组的迁移细胞数量提高100.1%(P<0.001),提示上调mi R-4463抑制血管平滑肌细胞迁移,而下调miR-4463促进血管平滑肌细胞的迁移。而细胞周期和凋亡实验的结果来看,miR-4463 mimic和miR-4463 inhibitor组与NC组之间并无明显差异。通过进一步Western Blot对迁移相关标志蛋白N-Cadherin和E-Cadherin进行检测。在股动脉组织中,N-cadherin蛋白在ASO患者组较正常对照组表达上调411.7%(P<0.001)而E-cadherin蛋白表达下调50.4%(P=0.0099)。在体外细胞水平上,N-cadherin在转染mi R-4463 mimic的HASMCs中较NC组下调61.3%(P<0.001),转染miR-4463 inhibitor的实验组较NC组上调86%(P<0.001);而E-cadherin在转染miR-4463 mimic的HASMCs中较NC组上调89.7%(P=0.0092),转染miR-4463 inhibitor的实验组较NC组下调67.3%(P=0.024)。对迁移标志蛋白的检测结果进一步确证mi R-4463对血管平滑肌细胞的迁移有重要作用。从细胞骨架实验的结果发现,miR-4463 mimic能促进血管平滑肌细胞维持收缩型状态,而miR-4463 inhibitor能促进血管平滑肌细胞向分泌型转换。因此,我们通过Western Blot实验检测了血管平滑肌细胞收缩型的标志蛋白SMA及分泌型标志蛋白OPN,实验结果同样提示,在股动脉组织中,OPN蛋白在ASO患者组较正常对照组上调1080%(P<0.001)而SMA蛋白下调45%(P=0.0105);在体外细胞水平上,OPN在转染mi R-4463 mimic的HASMCs中较NC组下调34%(P=0.0291),转染miR-4463 inhibitor的实验组较NC组上调34%(P=0.0422);而SMA在转染mi R-4463 mimic的HASMCs中较NC组上调43%(P=0.0058),转染miR-4463 inhibitor的实验组较NC组下调57%(P=0.0078)。实验结果表明转染mi R-4463 mimic与NC组对比,OPN的表达下调而SMA的表达上调;转染miR-4463inhibitor组与NC组对比,OPN的表达上调而SMA蛋白的表达下调。基于以上实验结果,miR-4463可能参与平滑肌细胞的表型转换。而对于miR-4463下游通路的研究,我们将平滑肌细胞分别转染NC、miR-4463 mimic、miR-4463 inhibitor后并分为三组,通过Western Blot实验检测P-JNK/JNK蛋白的表达发现,转染miR-4463 mimic后PJNK/JNK蛋白的表达较NC组上调,转染miR-4463 inhibitor后PJNK/JNK蛋白的表达较NC组下调,但差异无统计学意义,因此我们在ox-LDL干预的条件下再次检测P-JNK/JNK蛋白的表达。在oxLDL干预条件下,转染miR-4463 mimic组较NC组下调47%(P=0.0319),转染mi R-4463 inhibitor组上调68%(P=0.0209),并且具有统计学差异。在加入JNK通路的抑制剂SP600125干预转染miR-4463 inhibitor后的血管平滑肌细胞,在SP600125干预后能逆转miR-4463 inhibitor促进平滑肌细胞迁移的效应和细胞骨架改变的效应。在SP600125抑制剂干预后的miR-4463 inhibitor组迁移细胞数量显著减少60%(P=0.0021),并能逆转平滑肌细胞长梭状的变化,F-actin的荧光也明显增强。结论:1.MiR-4463在ASO患者较对照人群血浆中的表达下调表明miR-4463可能参与ASO疾病的病理发生过程。2.MiR-4463在ox-LDL干预条件下的血管平滑肌细胞中较正常对照组的表达下调,提示miR-4463可能参与ASO疾病的体外细胞水平的病理过程。3.miR-4463抑制血管平滑肌细胞的迁移,并且使平滑肌细胞维持收缩型状态。4.MiR-4463可能是通过靶基因调控JNK通路对血管平滑肌细胞的迁移作用及细胞骨架的改变产生调控作用。