DENN(differentially expressed in normal and neoplastic cells)结构域是一种进化高度保守的结构域，主要功能是作为Rab蛋白的鸟苷酸交换因子（GFF）。Rab蛋白是一类通过招募特异的效应分子控制囊泡识别转运的小G蛋白，做为细胞内的分子开关，在细胞内膜泡运输过程中发挥重要作用。FAM45A是一种真核生物保守基因，存在于阿米巴、海胆、昆虫和脊椎动物中，但功能未知。通过生物信息学预测，FAM45A蛋白与DENN家族蛋白有相似性，提示可能参与膜转运过程。利用荧光蛋白和免疫荧光标记，我们发现FAM45A蛋白主要定位于晚胞内体和溶酶体，进一步研究发现FAM45A定位于多囊泡胞内体(multiple vesicular endosome, MVE)中的胞内体囊泡（Intraluminal vesicles），提示FAM45A参与细胞内物质囊泡运输中的晚胞内体/溶酶体阶段转运通路。FAM45A基因沉默后，会导致细胞的晚胞内体分布更靠近细胞核，并且EGFR降解变慢，说明FAM45A影响了细胞信号介导的胞吞途径。综上所述，我们发现FAM45A是一种新的调节细胞囊泡运输过程的蛋白。　　目的：研究FAM45A在囊泡转运中的功能　　方法：　　一、FAM45A的细胞器定位　　1.构建Citrine-FAM45A融合表达载体，研究FAM45A的细胞器定位　　构建pCitrine-FAM45A融合表达载体，转染Hela细胞使之过表达带有绿色荧光的 FAM45A蛋白，同时共转染红色荧光标记细胞器marker，如EEA1、Lamp1等，利用激光共聚焦显微镜确定FAM45A的细胞器定位。为了观测FAM45A在胞内体囊泡上的定位，利用apilimod处理细胞，使膜状细胞器变大，进一步观察FAM45A在晚胞内体和溶酶体上的确切定位。　　2.研究内源性FAM45A的细胞器定位　　利用免疫荧光技术，同时孵育FAM45A抗体和细胞器marker抗体，如CD63、Lamp1等，通过激光共聚焦显微镜确定FAM45A的细胞器定位。利用NH4Cl碱性试剂处理细胞，使膜状细胞器变大，进一步研究内源性FAM45A在晚胞内体和溶酶体上的确切定位。　　二、FAM45A基因沉默后对细胞器表型和EFGR降解的影响　　1.构建FAM45A基因沉默细胞系　　包装FAM45A shRNA慢病毒颗粒，侵染Hela细胞，利用puromycin筛选出抗性细胞。利用q-PCR和Western Blotting(WB)分别检测FAM45A的mRNA表达和蛋白表达水平。　　2.研究FAM45A基因沉默后细胞器形态变化　　利用免疫荧光技术，分别孵育CD63和Lamp1抗体，观察FAM45A下调表达后对晚胞内体和溶酶体表型的影响；利用Lysotracker染料观察对酸性胞内体的变化。　　3.研究FAM45A基因沉默后对EGFR降解的影响　　用EGF刺激饥饿后的FAM45A基因沉默细胞系及对照组，提取0、10、90、150min总蛋白，利用Western Blotting检测EGFR降解速度的变化。　　结果：　　一、FAM45A的细胞器定位　　FAM45A蛋白主要定位于晚胞内体和溶酶体，进一步研究发现FAM45A定位于MVE中的胞内体囊泡（Intraluminal vesicles）上。　　二、FAM45A基因沉默后对细胞器表型和EFGR降解的影响　　1.构建成功FAM45A基因沉默细胞系，经q-PCR和WB检测，FAM45A的mRNA和蛋白表达水平均显著下降。　　2.FAM45A基因沉默后会导致CD63标记的晚胞内体的分布更靠近细胞核，Lamp1标记的溶酶体变大。　　3.FAM45A下调表达后导致EGFR降解变慢。　　结论：　　1.FAM45A定位于晚胞内体和溶酶体膜上，FAM45A还定位于MVE中的胞内体囊泡（Intraluminal vesicles）上。　　2.FAM45A影响晚胞内体和溶酶体的定位以及EGFR的降解，说明FAM45A参与调控晚胞内体/溶酶体阶段的囊泡转运。