据WHO估计，全球约10-15％的育龄夫妇不孕不育，据此推算，世界上不孕不育的总人数已超过8千万，其中约50％的原因在男方。而男性不育中又有半数病例表现为原因未明的原发性无精子症，主要是由遗传因素造成的。精子发生是一个连续的细胞分裂分化过程，包括精原细胞分裂增殖、精母细胞减数分裂和精子细胞变态三个主要阶段，最终产生成熟的精子。所有这些高度有序的过程均需要相关基因进行精确地调节，而这些重要基因的缺失或者功能异常都会导致无精子症。本研究从分子流行病学角度和分子生物学层面，分别探讨了精子发生过程中的3个重要基因，XRCC1、XPD和TERT基因，与无精子症的相关性及其可能的机制。这对于揭示男性生殖的分子调控机制及临床男性不育症的诊治具有一定的理论和实践意义。第一部分：XRCC1和XPD基因多态性与原发性无精子症易感性关系的分子流行病学研究XRCC1是碱基切除修复系统(base excision repair，BER)的重要成员，而XPD是核苷酸切除修复系统(nucleotide excision repair，NER)的重要成员，它们在维持基因组稳定性过程中起关键作用。大量研究报道，DNA修复基因的多态性会影响不同个体的DNA修复能力，从而导致其罹患肿瘤的风险不同。但迄今为止，DNA修复基因的多态性在男性不育中的作用却鲜有报道。本研究采用候选基因关联研究(candidate gene-based association study)方法，探讨了XRCC1和XPD基因单核苷酸多态与中国汉族人群男性不育遗传易感性的关系，研究对象包括171例原发性无精子症患者和247例生育正常男性，以聚合酶链式反应-限制性酶切片段多态性(PCR-RFLP)方法对XRCC1基因多态Arg194Trp、Arg399Gln和XPD基因多态Lys751Gln进行基因分型。以非条件Logistc回归模型分析基因多态与原发性无精子症的相关性，并用SAS分析基因-基因的交互作用。结果显示：本研究的三个基因多态均符合Hardy-Weinberg平衡；XPD 751 Gln等位基因的频率在无精子症病例组(11.40％)要显著高于对照组(5.67％)，(p=0.004)；XPD 751 Lys／Gln+Gln／Gln变异基因型携带者罹患无精子症的风险高于野生基因型Lys／Lys(OR=2.09，95％CI=1.22-3.57)；联合分析显示，同时携带XRCC1 194 Arg／Arg和XPD 751 Lys／Gln+Gln／Gln基因型者，罹患无精子症的风险增加了4.1倍(OR=5.100，95％CI=1.951-13.330)，同时携带XRCC1 399 Arg/Arg和XPD 751 Lys／Gln+Gln／Gln基因型者，罹患无精子症的风险也显著增加(OR=3.064，95％CI=1.440-6.523)。上述结果显示，XPD Lys751Gln基因多态可能是我国汉族人群原发性无精子症的遗传易感因素，有必要加大样本量证实本研究的结果。第二部分：TERT基因与无精子症的相关性研究及其机制探讨端粒位于真核细胞染色体末端，由串联排列的DNA重复序列和端粒结合蛋白构成，其作用为保护染色体末端并维护基因组稳定。端粒随细胞分裂次数的增加而不断缩短，当缩短到临界长度时就会导致细胞衰老、死亡。端粒酶是一种特殊的核糖核蛋白复合体，能以其自身RNA(TR)为模板反转录合成端粒重复序列，并将其加到染色体末端，从而恢复端粒长度，使细胞获得无限增殖能力。约90％以上的恶性肿瘤细胞都含有端粒酶活性，而在正常组织，仅有生殖细胞及造血干细胞系等可检测到端粒酶活性。端粒酶催化亚基—端粒酶逆转录酶基因(TERT)是端粒酶活性的限制组分，在原发性肿瘤、癌细胞系和永生化细胞系中，TERT基因的表达水平与端粒酶的活性一致，并与端粒酶的活化过程密切相关。进一步的研究显示：端粒长度、端粒酶活性及TERT基因的表达在精子发生过程中呈现特殊的时空性，但它们在男性生殖生理和病理中的确切作用仍未阐明。为了探讨端粒酶及其催化亚基TERT在男性生殖病理中的作用，本实验应用端粒酶重复序列扩增方法(TRAP)、定量PCR法和原位杂交法分别检测了小鼠睾丸和不同病理类型的无精子症患者睾丸活检标本中端粒酶的活性(TA)以及端粒酶催化亚基TERT的表达。并在此基础上，应用RNA干涉技术，对靶向TERT的RNA干涉后的小鼠精母细胞的生理改变进行研究，主要研究结果如下：1．实验中，TERT基因的表达水平与端粒酶的活性高度一致。在不同病理类型的无精子症睾丸标本中，TERT基因的表达水平有显著差异：唯支持细胞综合症(SCOS)病例中检测不出TA和TERT的表达；在生精正常的梗阻性无精子症(OA)中，TA和TERT的表达较高；而在成熟障碍所致的生精阻滞(MA)病例中，TA和hTERT的表达不同程度降低。无精子症患者精曲小管的hTERT原位杂交结果也显示，hTERT基因分布于除精子外的各级生精细胞，而非睾丸支持细胞。因此，hTERT表达水平可以反映睾丸生精细胞的状态，也可作为诊断不同病理类型的无精子症的辅助指标。2．核酸序列比对显示，小鼠与人TERT基因的同源性达78％；TERT基因在小鼠睾丸的各级生精细胞表达，在小鼠精母细胞系(GC2-spd)也富含TERT基因。3．构建靶向mTERT的RNA干扰载体，并转染小鼠精母细胞，发现干扰mTERT基因能够影响小鼠精母细胞的增殖；并且，干扰mTERT基因能够影响小鼠精母细胞对于氧化损伤的抵抗能力，给予同样的氧化应激压力，干扰TERT的精母细胞出现更为严重的DNA损伤效应。