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血吸虫病的发病机制主要是虫卵引起的肝脏和肠等组织脏器产生肉芽肿病变,并形成继发性的肝纤维化。尽管目前对于血吸虫病的发病机制尚未完全阐明,但是一些研究提示了可能参与血吸虫病的效应细胞和细胞因子。已有大量研究证实,肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)是血吸虫病肝纤维化的主要效应细胞。在血吸虫病炎症过程所分泌的多种细胞因子中,TGF-β1(transforming growth factor-β1)是目前公认的最关键的促纤维化细胞因子之一。Smad蛋白是唯一的TGF-β1受体后信使分子,介导TGF-β1信号从细胞膜传入细胞核,进而促进纤维化相关基因的表达,导致细胞外基质(extracellular matrix,ECM)沉积在肝脏形成肝纤维化。最近研究报道,microRNAs通过靶向作用于一个或多个TGF-β1/Smad信号通路的mRNA,促进或抑制HSCs的活化,从而影响肝纤维化发生、发展。课题组前期研究表明,日本血吸虫感染ICOS-Tg(ICOS transgenic,ICOS-Tg)小鼠后可显著上调ICOSL/ICOS信号发挥免疫效应。共刺激信号ICOSL/ICOS不仅介导Th2细胞极化,使免疫反应向Th2偏移,而且该信号也介导Th17的极化。ICOS信号的上调最终促进肝虫卵肉芽肿的形成及继发性肝纤维化。本研究应用ICOS-Tg小鼠及其野生型FVB/NJ小鼠作为日本血吸虫病实验动物模型,探讨共刺激信号ICOSL/ICOS对日本血吸虫感染小鼠HSCs活化及肝纤维化形成TGF-β1/Smad信号通路的影响,以期找到一个调控HSCs活化及肝纤维化的新靶点,为治疗肝纤维化提供一个新的免疫疗法。本研究共三个部分:一、日本血吸虫感染小鼠肝星状细胞的分离、鉴定和培养目的:日本血吸虫感染小鼠原代HSCs的分离、鉴定和培养,为后续实验奠定基础。方法:采用在体原位肝脏酶灌注法和密度梯度离心技术,分离感染前(0W)、感染早期(4W)和感染急性病变期(7W、9W)ICOS-Tg小鼠及FVB/NJ小鼠原代HSCs。根据台盼蓝拒染法鉴定原代HSCs的成活率,根据其在328nm波长紫外激发光下自发蓝绿色荧光特性以及其特异性表达神经胶质原纤维酸性蛋白(gfap)鉴定原代hscs的纯度。结果:新鲜分离的小鼠原代hscs的得率为(2.34±0.05)×106个/鼠,存活率在91%以上,其纯度达到90%。倒置荧光显微镜于波长328nm的紫外激发光下观察原代hscs,新鲜分离的hscs能够自发蓝绿色荧光。分离的原代hscs经gfap免疫细胞化学染色,细胞浆中出现红色荧光。原代培养过程中,细胞状态良好。结论:日本血吸虫感染小鼠后,分离培养的原代hscs存活率及纯度达90%以上满足后续实验要求。二、共刺激信号icosl/icos对hscs中促纤维化分子基因表达水平的影响目的:探讨共刺激信号icosl/icos的上调,对感染日本血吸虫icos-tg小鼠及fvb/nj小鼠原代hscs活化程度以及肝纤维化进程的影响。方法:应用trizolreagent抽提培养7d原代hscs的总rna,采用实时荧光定量pcr(realtimefluorescencequantitativepcr,real-timepcr)法检测icos-tg小鼠及fvb/nj小鼠原代hscsα-sma、collagen-Ⅰ、collagen-Ⅲ基因的表达水平,分析比较两者的动态变化。结果:日本血吸虫感染小鼠后,随着病程的进展,原代hscs中α-sma、collagen-Ⅰ、collagen-Ⅲ基因的表达水平逐渐上调(1.403~5.207,1.051~5.347,1.313~3.614,gene/β-actin)。icos-tg小鼠原代hscs中,α-sma、collagen-Ⅰ、collagen-Ⅲ基因的表达水平(1.760~5.753,1.258~6.262,1.488~4.470,gene/β-actin)显著高于同时期fvb/nj小鼠的表达水平。结论:共刺激信号icosl/icos的上调,能够促进hscs的活化以及肝纤维的发展。三、共刺激信号icosl/icos对肝纤维化形成tgf-β1/smad信号通路相关分子基因表达水平的影响目的:探讨共刺激信号icosl/icos的上调,对感染日本血吸虫icos-tg小鼠及fvb/nj小鼠肝纤维化形成tgf-β1/smad信号通路相关分子基因表达水平的影响。方法:应用Trizol Reagent抽提培养7d原代HSCs的总RNA,采用Real-time PCR法检测ICOS-Tg小鼠及FVB/NJ小鼠原代HSCs TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7基因的表达水平;应用RNAiso for Small RNA抽提培养7d原代HSCs的Small RNA,采用Real-time PCR法检测ICOS-Tg小鼠及FVB/NJ小鼠原代HSCs microRNA-21、microRNA-454基因的表达水平,分析比较两者的动态变化结果:日本血吸虫感染小鼠后,原代HSCs中TGF-β1、Smad2、Smad3、miR-21基因表达水平,自感染后4周开始上升,感染后7周达到较高水平,感染后9周有所下降,但是仍维持在较高的水平;ICOS-Tg小鼠原代HSCs中,TGF-β1、Smad2、Smad3、miR-21基因表达水平显著高于同时期FVB/NJ小鼠的表达水平(P<0.05)。此外,随着病程的进展,原代HSCs中Smad4基因的表达水平逐渐上调;ICOS-Tg小鼠原代HSCs中,Smad4基因表达水平显著高于同时期FVB/NJ小鼠的表达水平(P<0.05)。但是,原代HSCs中Smad7及miR-454基因的表达水平总体呈下调趋势,仅在感染后4周时Smad7基因表达水平略有升高;ICOS-Tg小鼠原代HSCs中,Smad7及mi R-454基因的表达水平显著低于同时期FVB/NJ小鼠的表达水平(P<0.05)。结论:共刺激信号ICOSL/ICOS在日本血吸虫感染小鼠肝纤维化形成中发挥重要的作用。共刺激信号ICOSL/ICOS的上调,可通过上调促纤维化因子的表达,下调抑纤维化因子的表达,从而促进肝纤维化的发生、发展。本研究结果表明,共刺激信号ICOSL/ICOS在HSCs的活化以及肝纤维化形成通路中发挥着重要的作用。上调共刺激信号ICOSL/ICOS,能够上调促肝纤维因子的表达,下调抑纤维化因子的表达,从而刺激HSCs的活化,促进肝纤维化的发生、发展。