番茄花叶病毒外壳蛋白与烟草IP-L蛋白的互作分析

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番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus, ToMV)是烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的成员之一,基因组为单链正义RNA,大小约为6.4kb,编码了3个非结构蛋白和17.6kDa的外壳蛋白(coat protein, CP)。通过汁液机械摩擦传播及种子带毒传播,番茄是其主要的寄主,对番茄的品质和产量造成了严重的影响。该病毒与寄主相互作用的机制尚不完全清楚。与外壳蛋白互作的蛋白IP-L (CP-interacting protein-L, IP-L)是在烟草体内发现的可以与ToMV CP在体内互作的蛋白,ToMV CP同IP-L的互作与黄化症状表达存在怎样的相关性?基于这一问题,我们首先要从ToMV CP同IP-L的互作机理问题入手,以两个蛋白间的互作为切入点,从根本上深入研究ToMV CP同IP-L的互作意义。为了进一步了解ToMV与寄主的互作机制,本文对ToMV CP与烟草IP-L的互作进行了初步分析。对IP-L的研究至今为止都只局限在烟草植株的叶片内,对于烟草植株其它部位IP-L的存在性一直未见提及。此外,对于其他茄科植物而言,这种与烟草花叶病毒CP存在互作的寄主因子是否也存在?针对烟草内IP-L的分布以及IP-L在茄科其他植物中的存在情况,我们提取烟草根、茎、叶及其他植物叶片的总RNA,用RT-PCR方法进行了检测和克隆分析。结果显示,IP-L并不是特异性地只在叶部存在,在茎中甚至根部都有存在同源基因。对辣椒、茄子、番茄、马铃薯中的IP-L同源基因克隆分析显示IP-L在这几种植物中同样存在。氨基酸序列分析显示,他们的IP-L氨基酸序列与烟草的IP-L氨基酸序列差异不大,与普通烟的氨基酸同源性分别是94.2%、94.7%、95.3%、94.9%,同时发现上述植物中的IP-L在与ToMV CP互作的必须区域--α螺旋区未见存在差别。张朝政等人的研究确定了IP-L与ToMV CP的体外结合位点,但是,这些位点是否也是在烟草植物体中二者发生互作的必需位点尚且不明确。因此,我将通过对IP-L基因与CP基因的突变或缺失,利用双分子荧光互补技术对存在相互作用的IP-L与ToMV CP进行进一步的证实,研究两个蛋白间相互作用的必需位点或片段以确定互作的关键部位。为了进一步确定ToMV CP与烟草IP-L在烟草体内的互作所需要的必需位点,我们对IP-L进行了两处突变(L9A及H12G),并且对CP进行两种缺失,缺失N端的106个氨基酸的CP缺失体以及缺失C端的105个氨基酸的CP缺失体。分别以IP-L突变体与缺失N端的106个氨基酸的CP缺失体及IP-L突变体与缺失C端的105个氨基酸的CP缺失体为两个目标蛋白,构建植物表达载体pUC-SPYCE-35S-△IP-L、pSPYNE-35S-△CP106和pSPYNE-35S-△CP105,利用双分子荧光互补技术分析了其互作情况。结果表明,△IP-L突变体(L9A,H2G)虽然使IP-L同ToMV CP的结合能力变弱,但不能使这种结合能力丧失。TOMV CP的缺失体△CP106和△CP105均能在烟草体内与IP-L互作。说明CP的C端54个氨基酸以及N端的55个氨基酸是实现其与IP-L互作的关键区。
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