随着我国人口老龄化日益严重，缺血性脑卒中已成为危害人民群众健康的致命杀手。在缺血性脑卒中的治疗中，无论是溶栓还是动脉介入治疗，目的都是使闭塞的脑动脉再通，恢复梗死区的血液供应，而再灌注过程往往加重组织细胞功能、代谢障碍及结构破坏，即出现再灌注损伤。寻找有效的细胞保护方法，防治脑缺血/再灌注损伤，促进脑卒中后中枢神经系统结构和功能重建，一直是脑缺血保护研究的重点和热点。1990年Kitagawa等首先提出了脑缺血预处理的概念，研究证实，缺血预处理是一种疗效肯定的具有脑缺血保护效应的预防手段，但这种预处理方法因其有创性难以直接应用于临床。近年来发现重复电针刺激大鼠“百会”穴预处理，可模拟缺血预处理的脑保护效应，诱导“脑缺血耐受”，但确切机制尚不完全清楚。Notch信号通路最初是在研究果蝇神经系统发育的过程中发现的，该通路涉及发育过程中的多个决定点，调控大脑发育过程中神经干细胞的存活和凋亡。新近研究发现，成年大脑缺血损伤后Notch通路也被激活，Notch通路的激活可以促进缺血后神经干细胞的存活。尽管现有证据显示电针脑保护作用与PI3K/Akt和JAK/STAT通路活化有关；以及Notch通路激活可通过活化PI3K/Akt，并与JAK/STAT相互作用，调节神经干细胞的存活、分化及缺血性脑损伤后的神经修复。但至今尚不清楚Notch通路是否参与电针预处理诱导的脑缺血耐受效应及发挥何种作用。本研究采用大鼠大脑中动脉阻闭（MiddleCerebralArteryOcclusion，MCAO）模型，利用分子生物学和形态学研究技术，观察缺血再灌注前后对照组及电针预处理组不同脑区中Notch通路的活性变化，证实Notch信号通路是否参与了电针预处理诱导的脑缺血耐受效应，并初步探讨其在电针预处理脑保护效应中的作用。本研究分三部分：第一部分为电针预处理对不同脑区Notch通路活性的影响，目的是研究电针预处理对缺血再灌注前不同脑区Notch通路活化的特点；第二部分为电针预处理对缺血再灌注后纹状体中Notch通路活性的影响，目的是研究电针预处理对缺血再灌注后纹状体中Notch通路活化的特点。第三部分为阻断Notch通路激活对电针预处理诱导的脑缺血耐受效应的影响，目的是研究Notch通路是否参与电针预处理诱导的脑缺血耐受效应，及发挥何种作用。　　第一部分电针预处理对不同脑区Notch通路活性的影响　　方法　　1.电针预处理对Notch通路相关分子mRNA含量影响　　清洁级雄性SD大鼠18只（280-320g），随机分为3组：假手术组（Sham）、对照组（CON）和电针预处理组（EA），EA组动物连续电针预处理5天，分别于第一次预处理后2h和最后一次预处理后24h处死，进行实时定量PCR(RT-PCR)，检测电针预处理后相关分子（Notch1、Notch4、Jag1、Hes1、Hes5）mRNA含量变化。　　2.电针预处理对不同脑区蛋白质NICD含量影响　　清洁级雄性SD大鼠18只（280-320g），分组同1，分别于第一次预处理后2h和最后一次预处理后24h处死，进行蛋白免疫印迹(Westernblotting)。　　结果　　1．电针预处理对缺血再灌注前不同脑区Notch信号通路相关分子mRNA的影响　　RT-PCR检测大鼠海马及纹状体中Notch1、Notch4、Jag1、Hes1、Hes5基因发现，单次电针预处理后2h，EA组纹状体中Notch1和Notch4基因表达明显高于Sham组及CON组（P<0.05），Jag1、Hes1和Hes5基因表达无统计学差异；而海马中各种基因表达均无统计学差异。重复电针预处理5d后间隔24h，EA组纹状体中Notch1、Notch4和Jag1基因表达明显高于Sham组及CON组（P<0.05），Hes1和Hes5基因表达无统计学差异；而海马中Notch信号通路相关基因表达均无统计学差异。　　2．电针预处理后不同脑区蛋白质NICD的含量变化　　Westernblotting显示，单次电针预处理后2h和重复电针预处理5d后间隔24h，EA组海马及纹状体中NICD的含量与Sham组及CON组比较均无统计学差异。　　第二部分电针预处理对缺血再灌注后纹状体中Notch通路活性的影响　　方法　　1．缺血再灌注后纹状体中蛋白质NICD的含量变化　　清洁级雄性SD大鼠24只（280-320g），随机分为2组：对照组（CON）和电针预处理组（EA），EA组动物连续电针预处理5天，于最后一次预处理后24h行大脑中动脉阻闭（MCAO）模型，经历2h缺血。动物分别于MCAO前及再灌注（I/R）2h、24h和72h处死，进行蛋白免疫印迹(Westernblotting)，检测缺血再灌注后纹状体中蛋白质NICD的含量变化。　　2．电针预处理后NICD阳性细胞的分布和细胞定位　　雄性SD大鼠6只，分组同1。再灌注24h后将动物处死，进行免疫荧光双标染色及细胞计数。　　3．缺血再灌注后纹状体中Hes1及Hes5基因表达变化　　清洁级雄性SD大鼠24只（280-320g），分组及处理方法同1。动物经历2h缺血，分别于MCAO前及再灌注2h、24h和72h处死，进行实时定量PCR(RT-PCR)，检测缺血再灌注后纹状体中Hes1及Hes5基因mRNA的含量变化。　　结果　　1．电针预处理增加缺血再灌注早期纹状体中NICD的含量　　NICD作为Notch通路活化的标志，缺血再灌注后2h及24h，EA组纹状体中NICD明显高于CON组(P<0.05)，EA组NICD含量于I/R2h开始升高，I/R24h达高峰，随后逐渐下降；CON组再灌注后NICD持续升高，于再灌注后72h达高峰，明显高于EA组(P<0.05)；缺血再灌注前，EA组与CON组NICD含量比较无统计学差异(P=0.35)。　　免疫荧光双标染色发现，再灌注后24h缺血侧纹状体中，EA组Notch1NICD阳性细胞明显多于CON组，EA组NICD与NEUN双标的阳性细胞数也明显多于CON组（P<0.05）。　　2．电针预处理增加缺血再灌注早期纹状体中Hes1及Hes5基因表达　　RT-PCR检测Hes1及Hes5基因发现，缺血再灌注后2h及24h，EA组Hes1基因表达明显高于CON组（P<0.05），EA组Hes1基因表达于I/R2h最高，随后逐渐下降，于再灌注后72h低于CON组（P<0.05）；缺血再灌注后24h及72h，EA组Hes5基因表达明显高于CON组（P<0.05）；缺血再灌注前，EA组与CON组中Hes1及Hes5基因mRNA含量比较无统计学差异。　　第三部分阻断Notch通路激活对电针预处理诱导的脑缺血耐受效应的影响　　方法　　1.侧脑室注射MW167对电针预处理后Notch通路活化的影响　　清洁级雄性SD大鼠6只（280-320g），随机分为2组：电针预处理组（EA）和MW167+电针预处理组（EA+MW167），动物经历连续5天30min电针预处理，最后一次预处理后24h行大脑中动脉阻闭（MCAO）模型。EA+MW167组动物于MCAO前30min行侧脑室注射γ-分泌酶抑制剂MW167。动物经历2h缺血，于再灌注后24h处死，进行蛋白免疫印迹(Westernblotting)，检测缺血再灌注后纹状体中蛋白质NICD的含量变化。　　2.γ-分泌酶抑制剂MW167对脑缺血耐受效应的影响　　清洁级雄性SD大鼠48只（280-320g），随机分为6组：假手术组（Sham），对照组（CON），电针预处理组(EA)，γ-分泌酶抑制剂组（MW167），电针预处理+γ-分泌酶抑制剂MW167组(EA+MW167)，电针预处理+溶剂组(EA+DMSO)。电针预处理及脑室注射方法同1，动物经历2h缺血，分别于I/R24h、48h和72h行Garcia神经功能障碍评分。I/R72h处死动物，TTC染色测定脑梗死容积。　　结果　　1.侧脑室注射γ-分泌酶抑制剂MW167有效阻断Notch通路激活　　Westernblotting显示，I/R24h，EA+MW167组纹状体中NICD含量明显低于EA组(P<0.05)，证实MW167（浓度为1mM）有效阻断Notch信号通路激活。　　2.γ-分泌酶抑制剂MW167拮抗电针预处理所诱导脑缺血耐受效应　　EA组、EA+DMSO组及MW167组在各个时间点NDS评分明显优于对照组，而EA组及EA+DMSO组NDS评分又明显优于MW167组。　　再灌注72h后，CON组脑梗死容积明显大于EA组，EA+MW167组脑梗死容积也明显大于EA组；而EA+MW167组与CON组脑梗死容积差异没有统计学意义(P=0.056)；EA+DMSO组与EA组脑梗死容积差异没有统计学意义(P=0.98)。　　结论　　1.缺血再灌注前，电针预处理可以增加纹状体中Notch通路的受体（Notch1和Notch4）和配体（Jag1）表达，但并未升高NICD的含量，故可认为其并未直接激活Notch通路。缺血再灌注后，电针预处理使纹状体中Notch通路在缺血再灌注早期激活，并较单纯缺血提前达峰。　　2.阻断Notch通路激活可以拮抗电针预处理诱导的脑缺血耐受效应，提示电针预处理可能是通过激活Notch通路诱导脑缺血耐受效应。