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目的构建BMP2过表达的心肌细胞模型,检测BMP2对心脏核心转录因子GATA4、MEF2C和Tbx5表达的影响,并研究BMP2对H9c2心肌细胞总组蛋白H3、基因启动子区组蛋白H3乙酰化修饰及组蛋白乙酰化酶(HATs)亚型p300和GCN5的调控作用,以证实我们的科学假设:BMP2是心肌细胞组蛋白乙酰化修饰的上游信号通路之一。方法(1)过表达BMP2的腺病毒(AdBMP2)及对照空腺病毒(AdGFP)在HEK293细胞中扩增后,分别以不同滴度转染大鼠H9c2心肌细胞,24h后荧光倒置显微镜下观察AdBMP2/AdGFP腺病毒转染细胞绿色荧光蛋白的表达情况,流式细胞术检测AdBMP2/AdGFP腺病毒转染效率。(2)AdBMP2/AdGFP腺病毒转染H9c2心肌细胞24h、48h和72h后收集细胞,提取mRNA,Real-Time qRT-PCR检测各处理组细胞BMP2、MEF2C、GATA4和Tbx5及HATs亚型p300和GCN5的mRNA表达水平,筛选最佳干预时间。(3)AdBMP2/AdGFP腺病毒转染H9c2心肌细胞48h后收集细胞,比色法检测各处理组H9c2心肌细胞核蛋白HATs活性,Western-blotting检测各处理组细胞总组蛋白H3的乙酰化水平,ChIP-Real-Time qPCR检测各处理组细胞MEF2C、GATA4和Tbx5启动子区组蛋白H3乙酰化水平。结果(1)AdBMP2转染H9c2心肌细胞24h后,荧光倒置显微镜下可见细胞中出现大量绿色荧光,流式细胞术检测结果显示AdBMP2转染效率可达90%以上。(2)AdBMP2转染H9c2心肌细胞24h、48h、72h后,BMP2及心脏核心转录因子MEF2C和GATA4的mRNA表达水平较对照组明显升高(P<0.05),并于转染后48h达到高峰,而Tbx5的表达没有明显变化。(3)AdBMP2转染H9c2心肌细胞48h后,HATs亚型p300的mRNA表达水平较对照组升高(P<0.05),而GCN5的表达水平与对照组相比没有明显的变化。(4)AdBMP2转染H9c2心肌细胞48h后,细胞核蛋白HATs活性较对照组明显升高(P<0.05),总组蛋白H3乙酰化水平也较对照组明显上调(P<0.05),MEF2C、GATA4启动子区组蛋白H3乙酰化水平亦相应升高(P<0.05),但Tbx5启动子区组蛋白H3乙酰化水平与对照组相比未见明显变化。结论(1)BMP2可上调H9c2心肌细胞中心脏核心转录因子MEF2C和GATA4的表达,而对Tbx5的表达没有影响。(2)BMP2可引起H9c2心肌细胞组蛋白H3高乙酰化,可能是H9c2心肌细胞组蛋白乙酰化修饰的上游信号通路之一。(3)BMP2引起的H9c2心肌细胞组蛋白H3高乙酰化可能与HATs亚型p300有关。(4)BMP2对MEF2C和GATA4启动子区组蛋白H3乙酰化的促进作用可能是BMP2引起MEF2C和GATA4表达上调的机制之一,而Tbx5启动子区组蛋白H3乙酰化未受BMP2的影响可能是Tbx5的表达不受BMP2调控的原因之一。目的使用HATs亚型p300的抑制剂姜黄素(Curcumin)来研究p300在BMP2致H9c2心肌细胞心脏核心转录因子GATA4和MEF2C高表达及组蛋白高乙酰化中的作用,以证实我们的科学假设:p300参与BMP2对H9c2心肌细胞心脏核心转录因子表达及组蛋白乙酰化修饰的调控作用。方法(1)AdBMP2转染H9c2心肌细胞后,用不同浓度的p300HAT活性抑制剂姜黄素(10μM,20μM,30μM,40μM)处理细胞(6h,12h,24h,48h),比色法检测各处理组细胞HATs活性,筛选姜黄素最佳处理浓度及时间。(2)AdBMP2和/或姜黄素处理H9c2心肌细胞后,Real-Time qRT-PCR检测各处理组细胞心脏核心转录因子GATA4、MEF2C和Tbx5及HATs亚型p300和GCN5的表达水平,Western-blotting检测各处理组细胞总组蛋白H3的乙酰化水平,ChIP-Real-Time qPCR检测各处理组细胞GATA4、MEF2C和Tbx5启动子区组蛋白H3乙酰化水平。结果(1)不同浓度(10μM,20μM,30μM,40μM)的姜黄素处理细胞24h后,H9c2心肌细胞的HATs活性明显下降(P<0.05),并于40μM达到最低点。40μM姜黄素分别处理细胞6h,12h,24h,48h后,HATs活性于处理后12h达到最低点。(2)AdBMP2和姜黄素共同处理H9c2心肌细胞后,心脏核心转录因子GATA4和MEF2C及HATs亚型p300的mRNA表达水平较单独AdBMP2处理组明显下降(P<0.05),而Tbx5及GCN5的mRNA表达水平在各处理组之间没有明显的变化。(3)AdBMP2与姜黄素共同处理H9c2心肌细胞后,细胞中总组蛋白H3乙酰化水平及GATA4和MEF2C启动子区组蛋白H3乙酰化水平较单独AdBMP2处理组明显下降(P<0.05),而Tbx5启动子区组蛋白H3乙酰化在各处理组之间没有明显的变化。结论(1)姜黄素可抑制HATs亚型p300的表达,而对GCN5的表达没有影响。(2)在H9c2心肌细胞中,p300HAT活性抑制剂姜黄素可拮抗BMP2引起的组蛋白H3高乙酰化及GATA4和MEF2C的高表达,说明p300参与BMP2对H9c2心肌细胞GATA4和MEF2C表达及组蛋白乙酰化的调控。(3)在H9c2心肌细胞中,Tbx5启动子区组蛋白H3乙酰化及其表达可能不受p300的调控。目的使用BMPs信号通路抑制剂dorsomorphin(DM)来研究BMPs在氧化应激反应所致H9c2心肌细胞组蛋白高乙酰化中的作用,以证实我们的科学假设:BMPs参与介导氧化应激反应所致H9c2心肌细胞组蛋白高乙酰化。方法(1)不同浓度H2O2(50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM)处理H9c2心肌细胞,24h后采用MTT法检测各处理组细胞的存活率。(2)5μM的BMPs信号通路抑制剂DM和/或适宜浓度的H2O2处理细胞,Real-Time qRT-PCR检测各处理组细胞BMP2及心脏核心转录因子GATA4,MEF2C和Tbx5的表达水平,Western-blotting检测各处理组细胞总组蛋白H3的乙酰化水平。结果(1)50、100和150μM浓度的H2O2对H9c2心肌细胞的存活率没有明显的影响,200、250、300、350、400和450μM浓度的H2O2处理H9c2心肌细胞后,细胞的存活率分别降低10.5%、16.9%、21.9%、32.4%、47.0%和58.6%。(2)400μM H2O2处理H9c2心肌细胞后,BMP2、GATA4、MEF2C和Tbx5的mRNA表达水平较空白对照组明显升高(P<0.05),细胞组蛋白H3的乙酰化水平亦相应升高(P<0.05)。(3)400μM H2O2和DM共同处理H9c2心肌细胞后,H9c2心肌细胞中总组蛋白H3乙酰化水平较单独400μM H2O2处理组有所下降(P<0.05),GATA4和Tbx5的mRNA表达水平也较单独400μMH2O2处理组有所降低(P<0.05),而MEF2C的mRNA表达水平较单独400μM H2O2处理组有所升高(P<0.05)。结论(1)利用H2O2成功构建H9c2心肌细胞氧化损伤模型。(2)400μM H2O2引起的氧化应激可上调H9c2心肌细胞BMP2、GATA4、MEF2C和Tbx5的表达并引起细胞组蛋白H3高乙酰化。(3)BMPs信号通路抑制剂DM对400μM H2O2引起的氧化应激所致H9c2心肌细胞组蛋白H3高乙酰化及GATA4和Tbx5表达上调具有一定的拮抗作用,说明BMPs(BMP2及其它BMPs亚型)参与介导氧化应激引起的心肌细胞组蛋白高乙酰化及GATA4和Tbx5的高表达,提示在氧化应激的病理状态下,BMPs可能也是心肌细胞组蛋白乙酰化修饰上游信号通路的组成部分,也提示氧化应激可能激活了上调Tbx5表达的BMPs亚型。(4)BMPs信号通路抑制剂DM可引起H9c2心肌细胞MEF2C的表达升高,提示在H9c2心肌细胞中,BMPs各亚型的综合效应可能是对MEF2C的表达起抑制作用,也提示氧化应激可能通过其它信号通路调控MEF2C的表达。