论文部分内容阅读
目的:通过人群研究,探讨PAHs代谢酶CYP1A1、GSTP1和GSTM1基因DNA甲基化修饰和单核苷酸多态性与外周血CYP1A1、GSTP1和GSTM1基因表达的可能关系;通过小鼠体内实验,研究CYP1A1、GSTP1和GSTM1 DNA启动子区CpG岛甲基化水平和基因表达水平在苯并[a]芘(0.2、2、20mmol/L)亚慢性染毒小鼠肝脏、肾脏、肺脏、大脑皮质和小脑中的变化,揭示DNA甲基化修饰在BaP致PAHs代谢酶基因表达异常中的可能作用。综合以上研究,分析基因甲基化修饰和单核苷酸多态性变异在BaP致PAHs代谢酶基因表达异常的可能作用,对早期发现职业高危人群,保护工人的健康,具有非常重要的科学意义和潜在的应用价值。方法:人群研究中,以158名职业接触PAHs的健康焦炉工为接触组,以60名健康在岗供水厂工人为对照组,采取自行设计的问卷,经横断面研究,调查人群性别、年龄、吸烟、饮酒、工种、受教育水平、生活习惯以及个人疾病史、家族史等情况;采集工人的班后晨尿,用高效液相色谱法检测尿1-羟基芘(1-OH-Py)的含量;采集空腹肘静脉血,用荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测研究对象外周血中CYP1A1、GSTP1和GSTM1的基因表达,用甲基化特异性PCR(MSP)检测研究对象外周血中CYP1A1、GSTP1和GSTM1 DNA启动子区CpG岛的甲基化水平,采用竞争性等位基因特异性PCR(KASP)检测CYP1A1、GSTP1的基因多态性,采用多重性PCR(Multiply-PCR)检测GSTM1的基因多态性;数据采用SPSS 22.0软件进行协方差分析和卡方检验。整体动物研究中,将32只SPF级雄性ICR小鼠,按体重随机分为溶剂(花生油)对照组,BaP低剂量(0.5 mg/kg)、中剂量(2.0 mg/kg)和高剂量(10.0 mg/kg)染毒组,每组8只。采用腹腔注射方式染毒,染毒时间固定在上午9点,隔天染毒1次,共染毒30次,染毒周期为2个月。溶剂对照组注射与染毒组等体积的花生油。染毒结束后,用实时定量PCR(qPCR)技术检测小鼠肝脏、肾脏、肺脏、大脑皮质和小脑中CYP1A1、GSTP1和GSTM1基因表达水平,采用甲基化特异性PCR(MSP)法检测CYP1A1、GSTP1和GSTM1启动子区DNA甲基化水平。数据分析采用统计软件SPSS 22.0,采用单因素方差分析进行多组间比较,采用LSD检验进行组间两两比较。结果:人群研究结果如下:1)BaP暴露与焦炉工外周血中CYP1A1、GSTP1和GSTM1甲基化修饰和基因表达的关系(1)与对照组相比,焦炉工尿中1-OH-Py的水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,焦炉工外周血中CYP1A1和GSTM1甲基化水平显著增高,相应的基因表达降低显著,差异有统计学意义(P<0.05);GSTP1甲基化水平及基因表达均显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)全部研究对象按照尿1-OH-Py水平的四分位数间距(P25、P50和P75)分为四个剂量水平,结果显示随着尿1-OH-Py水平的升高,CYP1A1和GSTM1甲基化水平逐渐升高,相应的基因表达降低,差异有统计学意义(P<0.05);GSTP1甲基化水平却没有显著改变(P>0.05),但其基因表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。2)外周血中CYP1A1、GSTP1和GSTM1甲基化修饰与基因表达的关系分析(1)Pearson相关分析结果显示,CYP1A1甲基化水平与基因表达呈负相关(r=-0.183,P=0.035)。将CYP1A1甲基化水平按三分位数间距(P33、P66)分为低、中、高三个亚组后分析,结果显示,与CYP1A1低甲基化组相比,中、高甲基化组的CYP1A1基因表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.01),且高甲基化组低于中甲基化组。(2)Pearson相关分析结果显示,GSTP1甲基化水平与基因表达呈正相关(r=0.175,P=0.043)。将GSTP1甲基化水平按三分位数间距(P33、P66)分为低、中、高三个亚组后分析,结果显示,与GSTP1低甲基化组相比,中、高甲基化组的GSTP1基因表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.01),高甲基化组低于中甲基化组。(3)Pearson相关分析结果显示,GSTM1甲基化水平与基因表达呈负相关(r=-0.178,P=0.047)。将甲基化水平按三分位数间距(P33、P66)分为低、中、高三个亚组后分析,结果显示,与GSTM1低甲基化组相比,中、高甲基化组的GSTM1基因表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.001),且高甲基化组低于中甲基化组。3)外周血中CYP1A1、GSTP1和GSTM1单核苷酸多态性与基因表达的关系(1)不同基因型在接触组和对照组之间均无显著性差异(P>0.05),等位基因频率也符合Hardy-weinberg平衡定律。(2)CYP1A1 rs1048943突变杂合型(GA)与突变纯合型(GG)者外周血CYP1A1的基因表达水平显著高于野生型(AA),差异有统计学意义(P<0.05);GSTP1 rs1695突变杂合型(GA)与突变纯合型(GG)者外周血GSTP1的基因表达水平显著低于野生型(AA),差异有统计学意义(P<0.05);GSTP1 rs762803突变杂合型(CA)与突变纯合型(CC)者的外周血GSTP1的基因表达水平与野生型(AA)相比,差异不具有统计学意义(P>0.05);GSTM1缺失型外周血GSTM1基因表达水平显著低于非缺失型,差异有统计学意义(P<0.05)。4)外周血中CYP1A1、GSTP1和GSTM1甲基化修饰和单核苷酸多态性对基因表达影响的交互作用分析(1)CYP1A1 rs1048943位点多态性与基因甲基化修饰对基因表达水平存在交互作用,差异有统计学意义(P<0.05);CYP1A1 rs1048943突变型和低甲基化修饰与CYP1A1基因表达水平的降低显著相关(P<0.05)。(2)未发现GSTP1 rs762803位点多态性、GSTP1 rs1695位点多态性与甲基化修饰对GSTP1基因表达水平存在交互作用(P>0.05);也未发现GSTM1基因缺失型和非缺失型与甲基化修饰对GSTM1基因表达水平有交互作用(P>0.05)。5)小鼠内实验结果:(1)与对照组相比,BaP染毒组(0.2、2、20mmol/L)CYP1A1基因表达水平在肝脏、肾脏、肺脏、大脑皮质和小脑中显著增高,差异有统计学意义(P<0.05);CYP1A1甲基化水平在肝脏、肺脏和大脑皮质中显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)与对照组相比,BaP染毒组(0.2、2、20mmol/L)GSTP1基因表达水平在大脑皮质和小脑中显著增高,在肾脏和肺脏中显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),但在肝脏中变化不显著(P<0.05);GSTP1甲基化水平在大脑皮质中显著降低(P<0.05),在在肺脏和肝脏中变化不显著(P>0.05)。(3)与对照组相比,BaP染毒组(0.2、2、20mmol/L)GSTM1基因表达水平在肝脏中显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),在肺脏和小脑中呈低剂量降低高剂量升高的变化,差异有统计学意义(P<0.05),而在大脑皮质中的变化不显著,差异无统计学意义(P>0.05);GSTM1甲基化水平在肝脏、肺脏和大脑皮质中均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:(1)随着尿1-OH-Py水平的增加,焦炉工外周血CYP1A1和GSTM1甲基化水平逐渐升高,相应基因的表达水平逐渐降低,GSTP1甲基化和基因表达水平均逐渐降低。(2)CYP1A1和GSTM1甲基化与相应基因的表达水平呈显著的负相关,而GSTP1甲基化水平与基因表达水平呈显著的正相关。(3)CYP1A1 rs1048943、GSTP1 rs762803等位基因变异以及GSTM1非缺失型与相应基因的表达水平升高有关。(4)CYP1A1 rs1048943位点基因单核苷酸多态性与甲基化对CYP1A1基因有交互作用,突变型和高甲基化联合降低基因的表达。(5)随着BaP染毒剂量的增加,小鼠各组织中CYP1A1甲基化水平显著降低,相应基因表达量显著增高;GSTP1甲基化在小鼠大脑皮质中显著降低,与大脑中GSTP1基因表达增高密切相关;GSTM1甲基化在小鼠肝脏中显著升高,而基因表达降低。