背景与目的 细胞凋亡(apoptosis)，又称细胞的程序性死亡(programmed cell death，PCD)，是细胞在一系列内源性基因的调控下发生的自然或生理性死亡过程。细胞凋亡过程阻滞与细胞增殖异常一样，是肿瘤发生的主要机制之一。因而，肿瘤细胞的凋亡是肿瘤研究发展的新领域，寻找高效低毒的能诱导肿瘤细胞凋亡的药物成为肿瘤治疗的新热点。 冬凌草甲素(oridonin)是从冬凌草中提取出来的有效抗癌成分，其主要化学结构是一种四环二萜类化合物，是治疗恶性肿瘤的药理基础。进一步的研究发现该药具有明显的抗DNA突变作用。另有资料表明，冬凌草甲素具有明显的抗自由基作用。此外，该药能显著的降低肿瘤细胞的钠泵转运活性。冯长伟等发现冬凌草甲素对人白血病细胞系HL-60细胞具有生长抑制作用，且可诱导细胞发生凋亡。张春玲等研究了冬凌草甲素诱导人子宫颈癌HeLa细胞凋亡的作用机制，发现冬凌草甲素通过激活caspase途径诱导HeLa细胞凋亡。还有研究证实冬凌草甲素对人肺癌SPCA-1细胞株具有明显的体外抗肿瘤作用，并发现其抗肿瘤的机制主要表现为细胞端粒酶活性明显下调，推测凋亡途径可能参与了端粒酶活性的调控。越来越多的研究证明，冬凌草甲素对多种肿瘤具有生长抑制作用，有望郑州大学医学院硕士学位论文(2004届)开发成为一种高效、低毒的新型抗肿瘤药物。 大肠癌是常见的恶性肿瘤之一，近年来发病率迅速增长。我国大肠癌的发病率已从30年前的10/10万上升到现在的30/10万，在恶性肿瘤的排名中，从第6位上升到第3位。大量的研究资料表明冬凌草甲素对多种肿瘤具有生长抑制作用，但冬凌草甲素对结肠癌的作用国内外尚未见有报道。本课题拟通过体外实验探讨冬凌草甲素诱导人结肠癌细胞株HCT-8凋亡作用的机理。技术路线为:用MTT法测定不同浓度冬凌草甲素对细胞的生长抑制作用，采用HE染色法观察冬凌草甲素诱导人结肠癌细胞株HCT-8凋亡的形态学变化;以免疫组化技术检测凋亡相关蛋白caspase3和stirvivin的表达情况，利用流式细胞仪测定不同浓度的冬凌草甲素作用不同时间诱导细胞凋亡的凋亡率及细胞周期的变化，以期探讨冬凌草甲素诱导细胞凋亡的作用机理，从而为冬凌草甲素作为抗肿瘤药物应用于临床提供理论依据。方法 1.细胞株选用人结肠癌细胞株HCT-8为材料;2.MTT比色法测定不同浓度冬凌草甲素对结肠癌细胞的生长抑制率;3 .HE染色法观察5件留ml冬凌草甲素作用48小时后的细胞形态学变化;.4.免疫组化sP法检测5件留耐冬凌草甲素作用48小时后实验组与对照组细胞凋亡相关基因CasPase3、Survivin的蛋白表达变化;5，流式细胞仪检测不同处理组的周期时相变化及凋亡情况;6.实验数据经SPSS10.O统计软件处理，采用正态性检验，单因素方差分析，独立样本t检验，xZ检验，以。=0.05为检验水准。结果 1.MTT法结果显示，不同浓度的冬凌草甲素对HCT-8细胞作用48小时后，细胞生长和增殖受到不同程度的抑制。随着冬凌草甲素浓度的增加，对HCT-8细胞的生长抑制作用逐渐增加，且有一定的剂量依赖性，1.25拼岁ml、2.5林到ml、5林g/ml、10卜g/ml、20林g/耐冬凌草甲素的抑制率分别为1 0.500，0、25.65%、47.460，0、70.79%、80.16%。2.HE染色法结果显示5协留ml冬凌草甲素作用48小时后，出现细胞核固缩，染色质浓集，边聚，呈新月型紧贴于核膜周边;核碎裂，核膜内陷等细胞凋亡的形态学变化;3.免疫组化SP法结果显示，凋亡相关基因CasPase3、Sulvivin的阳性产物位于细胞浆，实验结果阳性时胞浆呈棕黄色颗粒。郑州大学医学院硕士学位论文(2004届)5林留nil冬凌草甲素作用于HCT-8细胞48小时后，与对照组相比，实验组Caspase3蛋白表达的阳性率明显升高(0.610士5.04E一02)、Survivin蛋白表达的阳性率明显降低(0.338士3.13E一02)，与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。4流式细胞仪检测结果提示，冬凌草甲素可将HCT-8细胞阻滞于GZ/M期并诱导HCT-8细胞凋亡，且其阻滞率及凋亡率随着药物浓度的增高及作用时间的延长而升高。结论1冬凌草甲素对人结肠癌细胞株HCT-8的生长具有明显的生长抑制作用，且在 一定浓度范围内存在量效依赖关系。2冬凌草甲素作用于HCT-8细胞48小时后，细胞中Caspase3蛋白表达明显升 高，Survivin蛋白表达明显下降。3冬凌草甲素可将结肠癌HCT-8细胞阻滞于GZ侧期，且可通过caspase途径诱 导凋亡，其阻滞周期能力及凋亡率在一定范围内呈剂量、时间依赖性。4冬凌草甲素可望作为抑制生长、诱导凋亡的抗肿瘤药物应用于肿瘤的化学治 疗。