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目的大气PM2.5作为空气污染物之一,与肺癌的发生发展有着明显的关联,本研究探讨Wnt/β-catenin信号通路在大气PM2.5引起人支气管上皮细胞（Beas-2B）、非小细胞肺癌细胞（A549）p16抑癌基因启动子甲基化改变中的关键作用;探讨Wnt/β-catenin信号通路在大气PM2.5引起上述两种细胞生物行为改变中的作用。分别用正常支气管上皮细胞、肺癌细胞建模进行体外实验,从致癌、促癌两个角度研究大气PM2.5对肺癌的相关分子机制。方法根据课题组前期大气PM2.5采集方法,采集大气PM2.5,干燥、称重后溶解于DMSO,将其浓度定为100 mg/mL备用。不同浓度大气PM2.5染毒Beas-2B、A549细胞24小时后,MTT、细胞划痕及Transwell实验确定细胞染毒浓度;同样以MTT实验确定DKK-1抑制剂最佳浓度;Western blot法检测经不同浓度PM2.5处理及加入抑制剂DKK-1与PM2.5共孵育后细胞中Wnt/β-catenin通路各蛋白、DNA甲基化转移酶1（DNMT1）以及EMT相关蛋白表达水平;RT-qPCR法检测细胞中Wnt/β-catenin通路各因子mRNA及DNA甲基化转移酶（DNMTs）mRNA表达水平;甲基化特异性PCR（MSP）法检测细胞中p16抑癌基因甲基化水平;细胞划痕实验检测抑制剂DKK-1与PM2.5共孵育后A549细胞迁移力水平改变;Transwell实验检测加入抑制剂DKK-1与PM2.5共孵育后A549细胞侵袭力水平改变。结果Wnt/β-catenin通路在大气PM2.5引起A549细胞p16甲基化及细胞生物行为学改变中的作用1.MTT实验确定染毒及DKK-1剂量。染毒处理24 h后,当剂量为100μg/mL时细胞存活率接近81%,且与对照组相比有统计学意义（P<0.01）。故本研究选择染毒剂量包括0、25、50、100μg/mL,且染毒时间定在24 h。随着DKK-1浓度增高,细胞存活率呈下降趋势,当DKK-1剂量为50 ng/mL,细胞存活率为94%,与对照组相比无统计学差异。2.PM2.5引起细胞甲基化水平上升。与对照组相比,随着染毒剂量升高,DNMT1蛋白表达水平及p16基因甲基化水平上升,且染毒浓度为100μg/mL时,效应最强（P<0.01）。3.PM2.5引起细胞生物行为学改变。与对照组相比,当染毒浓度为25、50μg/mL时,细胞迁移力相比明显增加（P<0.01）,当染毒浓度继续上升至100μg/mL时,细胞迁移力无明显改变。相比于对照组,25μg/mL的染毒组,细胞侵袭力增强,但随着PM2.5浓度继续升高至50、100μg/mL时,侵袭力明显下降（P<0.01）。故将细胞分为0、6.25、12.5、25μg/mL四组,检测细胞EMT蛋白水平,与对照组相比,随着染毒剂量的提高,Vimentin蛋白表达水平上调而E-cadherin蛋白表达水平下降（P<0.01）。4.PM2.5激活Wnt/β-catenin信号通路。随着染毒剂量提升,p-GSK-3β/GSK-3β比值及β-catenin、p-GSK-3β蛋白表达水平上调而APC蛋白表达水平下降。5.DKK-1抑制PM2.5激活的Wnt/β-catenin信号通路。与单独染毒组相比,PM2.5与DKK-1共孵育组p-GSK-3β/GSK-3β比值及β-catenin、p-GSK-3β蛋白表达水平下降而APC蛋白表达水平上调,并皆具有统计学意义（P<0.01）。6.DKK-1抑制PM2.5激活的Wnt/β-catenin信号通路后p16甲基化及细胞生物行为学改变。与单独染毒组相比,PM2.5与DKK-1共孵育组DNMT1蛋白表达水平及p16甲基化水平下降,且细胞迁移力及侵袭力下降,EMT蛋白Vimentin表达水平下降而E-cadherin蛋白表达上调（P<0.01）。Wnt/β-catenin通路在大气PM2.5引起Beas-2B细胞p16甲基化及EMT蛋白表达水平改变中的作用1.MTT实验确定染毒及DKK-1剂量。染毒处理24 h后,当剂量为100μg/mL时细胞存活率接近75%,且与对照组相比有统计学意义（P<0.01）。故本研究选择染毒剂量包括0、25、50、100μg/mL,且染毒时间定在24 h。随着DKK-1浓度增高,细胞存活率呈下降趋势,当DKK-1剂量为50 ng/mL,细胞存活率为93%,与对照组相比无统计学差异。2.PM2.5引起细胞甲基化水平上升。与对照组相比,随着染毒剂量升高,DNMT1蛋白、DNMT3b mRNA表达水平及p16基因甲基化水平上升,且染毒浓度为100μg/mL时,效应最强（P<0.01）。3.PM2.5引起细胞EMT蛋白水平改变。与单独TGF-β1处理组相比,随着染毒剂量升高,Vimentin蛋白表达水平上调而E-cadherin蛋白表达水平下降（P<0.01）。4.PM2.5激活Wnt/β-catenin信号通路。随着染毒剂量提升,p-GSK-3β/GSK-3β比值及β-catenin、p-GSK-3β蛋白表达水平上调而APC蛋白、APC mRNA及DKK-1mRNA表达水平下降（P<0.01）。5.DKK-1抑制PM2.5激活的Wnt/β-catenin信号通路。与单独染毒组相比,PM2.5与DKK-1共孵育组p-GSK-3β/GSK-3β比值及β-catenin、p-GSK-3β蛋白表达水平下降而APC蛋白及mRNA表达水平上调,并皆具有统计学意义（P<0.01）。6.DKK-1抑制PM2.5激活Wnt/β-catenin信号通路后p16甲基化及细胞EMT蛋白水平改变。与单独染毒组相比,PM2.5与DKK-1共孵育组DNMT1蛋白、DNMT3b mRNA表达水平及p16甲基化水平下降,且EMT蛋白Vimentin表达水平下降而E-cadherin蛋白表达上调（P<0.01）。结论从促癌的角度阐释了大气PM2.5染毒A549细胞24 h后,A549细胞抑癌基因p16甲基化水平上升,细胞EMT蛋白表达水平上升,细胞侵袭力、迁移力增强,并且Wnt/β-catenin通路参与到PM2.5诱导的p16基因甲基化水平上升及细胞生物行为学改变的过程中;此外从诱癌的角度阐释了染毒正常Beas-2B细胞后,p16基因甲基化水平上升,细胞EMT蛋白表达水平上升,且Wnt/β-catenin通路同样参与到此过程中。从诱癌、促癌两个角度研究大气PM2.5对肺癌的相关分子机制,进一步为细颗粒物暴露导致肺癌的防治提供新思路和新靶点。