莱氏野村菌（Nomuraea rileyi=Metarhizium rileyi）是一种分布广泛的虫生真菌，因其在自然环境中可以感染多种鳞翅目的害虫，可以作为潜在的生物杀虫剂而逐渐受到关注。但是莱氏野村菌分生孢子的产孢需要一定的光照温度等苛刻条件，且不耐储存，这对于以分生孢子作为杀虫制剂有效成分的真菌来说，是制约其工业化生产的重要因素。本实验室经过长期的研究成功实现了莱氏野村菌微菌核的人工诱导，微菌核具有生产成本低、耐高温、耐储存、可持续侵染等特点，因此可以作为分生孢子的有效替代品用于杀虫制剂的生产。　　本实验室在2012年采用比较转录组技术研究微菌核形成的分子机理，发现在微菌核发育过程中伴随着活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的产生。而已有研究表明真菌在应对外部渗透和氧胁迫压力时，两个跨膜蛋白Sholp和Sln1p发挥重要的感受作用，这两个蛋白分别将信号传递给高渗透压甘油信号途径(High osmolarity glycerol，HOG)。另一方面，前期研究表明，莱氏野村菌Nrsho1和Nrsln1基因在调控微菌核的发育方面发挥着重要功能。鉴于此，本文以莱氏野村菌为研究对象，根据转录组EST库信息，成功克隆得到HOG通路中Nrsho1与Nrsln1的下游基因Nrssk1与Nrpbs2基因，利用农杆菌介导的莱氏野村菌的遗传转化技术，成功对两个基因进行了单敲除，并研究其基因功能，得到如下的研究结果：　　①Nrssk1与Nrpbs2基因的克隆与序列分析　　根据莱氏野村菌转录组文库Unigene序列，成功克隆出了莱氏野村菌Nrssk1与Nrpbs2基因的部分序列，并利用FPNI-PCR方法扩增得到其基因全长序列，经分析发现：Nrssk1开放阅读框长2929bp，含有2个内含子，编码929个氨基酸，其蛋白质分子质量为100.2kDa，理论等电点为10.04；Nrpbs2开放阅读框长2038bp，含有1个内含子，编码649个氨基酸，其蛋白质分子质量为68.5kDa，理论等电点为5.80。其二级结构以随机卷曲和α螺旋为主要构象。Nrssk1p隶属于REC超家族，该家族蛋白含有信号接收结构域；Nrpbs2p隶属于类PKc超家族，该蛋白激酶超家族主要由丝氨酸/苏氨酸特异性和酪氨酸特异性蛋白激酶的催化结构域组成。经过同原序列比对与系统进化分析，我们发现Nrssk1与Nrpbs2基因在进化关系上与绿僵菌属ssk1与pbs2基因有最近的亲缘关系。　　②Nrssk1与Nrpbs2敲除载体构建和突变菌株筛选　　采用同源双交换的方法，通过FPNI-PCR的方法扩增两个基因编码区相邻的上下游同源序列，结果分别扩增得到1500bp左右的未知序列，并以此构建得到Pzp-Ptrpc-Hph-Nrssk1和Pzp-Ptrpc-Hph-Nrpbs2基因敲除载体。通过农杆菌介导的莱氏野村菌的遗传转化技术转化莱氏野村菌芽生孢子，筛选得到了突变菌株△Nrssk1与△Nrpbs2。　　③突变菌株的表型分析　　分析两个突变菌株的表型相对于野生型菌株的变化，我们发现，△Nrpbs2整体生长进程特别是分生孢子萌发的前期相较于野生型明显延迟，在培养后期，菌丝丰厚，分生孢子梗分叉较多，产孢困难，产孢量较野生型显著降低。△Nrssk1相较于野生型在菌体发育方面没有明显变化。在逆境胁迫实验中，△Nrpbs2对渗透压胁迫敏感，菌丝生长受到抑制，且对盐离子浓度的极限耐受力下降。在应对氧胁迫，尤其是在甲萘醌提供的氧胁迫环境中，△Nrpbs2的生长受到了较大的限制，其生长进程发生了较明显的延迟。而△Nrssk1则只有在较高程度的渗透压胁迫和氧胁迫下，菌落才出现了较野生型明显的变化，菌株的生长受到限制，产孢量不同程度的下降。另外，两个突变菌株对湿热胁迫均不敏感。在微菌核的诱导实验中，相比于野生型微菌核，△Nrssk1的微菌核相比于野生型微菌核，色素沉积下降，且致密程度也变得更为疏松；这一点在△Nrpbs2菌株中变得更为明显，其色素的下降程度可在肉眼观察下感知。并且，两个突变菌株在微菌核的产量（数量）及总生物量上均有显著下降。以上说明两个基因对莱氏野村菌应对多种压力胁迫以及微菌核的正常生长发育是必须的。　　④Nrssk1与Nrpbs2表达模式分析　　收集莱氏野村菌在微菌核发育的几个时期的样品，并利用实时荧光定量 PCR分析两个基因在这几个时期的表达水平，结果发现，Nrssk1与Nrpbs2两个基因莱氏野村菌微菌核发育过程中有着相似的表达趋势，在微菌核诱导的初期36h，两基因均有较高水平的表达，之后均有下降，并在第84h达到最高的表达水平，此时正处于微菌核形成的高峰期，这说明两基因均参与微菌核的发育并发挥了一定的作用。　　当以突变菌株进行微菌核的诱导并以实时荧光定量PCR分析基因缺失对其他基因的影响时，我们发现两基因会在一定程度上协同发挥作用，并与CWI通路发生作用互补。　　⑤突变菌株毒力分析　　将突变菌株的分生孢子分别以体表点滴和体内注射的方式侵染斜纹夜蛾三龄幼虫测定突变菌株的毒力变化，结果表明，△Nrssk1菌株的半致死时间LT50分别为6.18d和6.43d相比野生型增长了1.18d和1.36d；△Nrpbs2菌株的半致死时间LT50分别为6.83d和6.97d，相比对野生型菌株增长了1.83d和1.90d。这说明两基因均在一定程度上影响这莱氏野村菌对斜纹夜蛾幼虫的侵染毒力。　　⑥结论　　以上结果表明，Nrssk1与Nrpbs2两个基因在莱氏野村菌应对外界胁迫、微菌核的发育以及菌株的毒力方面均发挥一定的作用，且其功能又有相似之处，但发挥作用的程度并不一样，而这也是符合两基因在HOG通路中的相对位置的。