锌(Zn)和双酚A (BPA)是典型的低毒性环境污染物,已有证据表明它们会对水生生物和人类生殖系统构成潜在威胁。Zn是机体必需微量元素,但其过量累积又会危害个体健康,其毒理效应机制复杂。BPA是典型的环境内分泌干扰物,影响生物性腺发育和性别特征,进而影响生物种群性别比例,对环境生态系统造成破坏。而这二者生殖毒性的分子机制目前尚不明确。牡蛎是富Zn能力最强的生物之一,具有雌雄同体和雌雄转换现象,性腺发育周期短且高度发达,是研究环境污染物生殖毒性的常用模式生物。本文以福建牡蛎为对象,研究在长期胁迫条件下,ZnCl2和BPA对牡蛎性腺的慢性毒性效应,以ICP-MS和GC-MS/MS方法分别分析牡蛎性腺Zn及BPA的富集情况,再利用LC-MS/MS方法分析胁迫条件下牡蛎性腺全蛋白质组表达谱变化情况以探究Zn2+与BPA对牡蛎的生殖毒理效应机制。首先进行了ZnCl2毒理蛋白质组学研究。通过联合运用组织切片、SOD与CAT酶活测定以及ICP-MS检测这三种技术,本研究发现伴随着氧化应激对性腺发育所造成的抑制作用的加剧,雌雄牡蛎性腺对Zn的富集量不减反增,表明牡蛎性腺富Zn水平与其性腺发育程度呈反比关系。这种现象过去也曾被报道过。我们推测牡蛎性腺富Zn水平同其生殖周期调控有关。同时,本文蛋白质组的分析结果证实了牡蛎主要通过Zip家族、ZnT家族和金属硫因蛋白/硫因蛋白体系参与调控牡蛎性腺内细胞Zn的生理稳态,而且还发现了cavortin蛋白可能在维持细胞Zn内稳态中也发挥着重要作用。对于其他差异表达蛋白,本文将它们构建成STITCH(蛋白功能关联)网络,为了便于分析,进一步将全网络细分为几个小的功能网络,涉及能量代谢、氧化应激、基因表达调控等。对STITCH网络的分析,本文发现,Zn+胁迫后雄性性腺糖代谢紊乱,供能从依赖于糖类转为脂肪动员,而雌性仍然以糖类代谢为主；同时胁迫还造成雄性性腺基因活化,但却使雌性加强了基因沉默；此外,酶活分析显示雄性性腺抗氧化胁迫酶被强烈抑制,而这些酶的活性在雌性性腺中却逐渐恢复。本文推测,雌雄性腺对Zn+胁迫的应答机制不同,但雌性展示了较雄性更强的适应性。此外,本文还分别从雄性与雌性性腺的差异表达蛋白中筛选出了指示Zn2+污染的候选生物标志蛋白,雄性的包括14-3-3蛋白、半乳糖基转移酶、丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶、半乳糖基转移酶等,雌性的包括了半椎蛋白、环己二烯脱氢酶、ABC转运通透酶等。这些差异表达蛋白也有助于进一步认识Zn对雄性与雌性牡蛎的生殖毒性机制。其次,进行了BPA毒理蛋白质组学的研究。本文发现BPA的毒理学效应与Zn2+完全不同。组织切片与性腺指数分析共同表明,对雌性而言,lppm BPA的慢性胁迫刺激了卵巢的发育,当浓度为2ppm时,却显示出抑制效应。而雄性方面,lppm与2ppm浓度的BPA均呈抑制效应。可见BPA的生殖毒理效应同它的浓度和施用对象的性别有直接关系。BPA生殖毒理机制主要同其类雌激素效应相关,它能结合雌激素受体,还可充当转录因子,且当它结合至雌激素受体应答元件时候会对基因表达产生影响,并对激素的生理功能产生干扰。故BPA的毒性效应机理因雌雄而异。本文利用蛋白质组学手段进一步发现,对于雌性性腺,BPA抑制了牡蛎性腺内多种转录延伸因子表达,可能干扰了基因的转录调控；抑制细胞骨架蛋白tubulin可能造成滤泡的合成受阻；刺激雌激素受体,激活卵黄蛋白原的表达,展现雌激素作用；通过抑制精细胞自身抗原蛋白的表达,阻挡生殖细胞通过S期,可能由此造成卵母细胞大量丢失等。然而,对于雄性牡蛎,机制有所不同,BPA抑制了骨膜蛋白合成,胶原蛋白合成也因此合成不足,从而可能抑制了雄性精巢输精管的生成,造成雄性性腺松散、萎缩；通过电压依赖阴离子通道蛋白2与骨膜蛋白的调控,可能干扰精巢内细胞凋亡的发生；并通过上调精细胞蛋白Sp17可能干扰牡蛎性别的分化与精子鞭毛、纤毛结构的形成；BPA还刺激钙调蛋白的上调,可能影响了精子的发生、精子的活动性,等等。这些雄性与雌性的差异表达蛋白被证实具有成为指示BPA污染的生物标志蛋白的潜力。另外,STITCH同样成功地应用于本实验的研究,所得的STITCH网络也被细分为一些小功能网络,包括能量代谢、氧化应激、基因转录调控以及卵黄蛋白原家族间相互作用等。STITCH网络分析提示,BPA胁迫后雄性增强了糖酵解与TCA循环的供能,雌性仅上调了ATP合成酶的表达；BPA促进了雌性的转录延伸反应,而对雄性则不明显；受BPA类雌激素作用,雌雄性腺的卵黄蛋白原均显著上调表达,而雌性性腺内上调幅度更大。另外,酶活分析显示受胁迫后,雄性与雌性性腺的抗氧化酶活性经抑制后逐步上调,而雌性上调更快；本文推测,BPA对雌性牡蛎充分发挥了类雌激素效应,而对雄性则较不明显,BPA对雄性可能氧化性胁迫效应大于类雌激素作用效应。