【摘 要】
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外泌体miRNA可以介导细胞间通讯,通过被受体细胞摄取,在受体细胞中调节靶基因并发挥生物学功能。肿瘤细胞的外泌体可以调控的癌症的发生发展。大量研究表明,外泌体及其亲代细胞中的miRNA表达谱中miRNA的种类和丰度都不一样,这表明miRNA选择性地被分选到外泌体中。尽管有几项研究已经揭示了某些特定的miRNA分选的机制,但需要更多的研究来全面地探究外泌体中miRNA的分选机制。基于CRISPR/C
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外泌体miRNA可以介导细胞间通讯,通过被受体细胞摄取,在受体细胞中调节靶基因并发挥生物学功能。肿瘤细胞的外泌体可以调控的癌症的发生发展。大量研究表明,外泌体及其亲代细胞中的miRNA表达谱中miRNA的种类和丰度都不一样,这表明miRNA选择性地被分选到外泌体中。尽管有几项研究已经揭示了某些特定的miRNA分选的机制,但需要更多的研究来全面地探究外泌体中miRNA的分选机制。基于CRISPR/Cas9技术的人类基因组高通量筛选目前已被广泛应用于各个领域。基于这种技术,研究人员能够更全面地探索基因的功能并了解更多的生物发生过程。目前,全基因组功能基因筛查是最为全面的基因检测及验证手段之一,且已经应用于高通量筛选编码基因、启动子及增强子、长链非编码RNA序列、以及多功能干细胞活力的基因、癌症基因、以及一些肿瘤治疗过程的耐药基因。本文中,我们采取全基因组筛选工具—Genome-wide screening探索研究肿瘤外泌体miRNA的分选机制。我们发现miR-21在肿瘤外泌体中高表达,故我们以miR-21为切入点,探究肿瘤外泌体中miR-21分选的机制。用CRISPR-Cas9全基因组敲除文库感染细胞并培养单个的单克隆细胞株,选择外泌体miR-21表达降低的细胞株进行进一步研究。我们的筛选原则是:每株细胞中有且只有一条g RNA进入并整合到基因组上且外泌体中miRNA的表达水平有变化。文库筛选结果显示:符合标准的细胞一共60株,其中外泌体水平miR-21升高的细胞8株,miR-21表达含量降低的12株,miRNA-21表达含量没有差异性的一共40株。我们将这些细胞株提取基因组并进行二代测序,根据测序结果比对g RNA基因文库的序列,选择影响外泌体中miR-21表达含量下降的基因。在这些基因中我们选择其中6个细胞株,并通过生物学实验验证我们前面的筛选结果。在6个细胞株中,我们选择YWHAE基因,探究它对于外泌体中miR-21的分泌的影响。YWHAE影响外泌体中miR-21的分泌,我们猜测它可是通过影响外泌体的生成而影响外泌体中miR-21的分泌。为探究YWHAE对于外泌体生成的影响,我们构建了稳转细胞株He La NC和He Lash-YWHAE,并通过NTA发现YWHAE不影响外泌体分泌的粒径大小,但影响相同数量细胞生成外泌体的数量。Western blot和免疫荧光结果发现YWHAE影响外泌体标志性蛋白的表达。我们猜测YWHAE可能通过影响外泌体跨膜蛋白的方式影响外泌体的分泌。为探究YWHAE在体外的功能,我们检测了YWHAE在各种细胞系表达情况,最终选择YWHAE更高表达的结直肠癌细胞系—SW620,然后构建了稳转细胞株SW620NC,SW620sh-YWHAE,SW620YWHAE+Flag,分别检测了基因YWHAE对于SW620细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响。最终结果显示:、在结直肠癌细胞系和结直肠癌病人样本中,YWHAE蛋白高表达,并且在SW620细胞中,YWHAE扮演着一个原癌基因的功能和作用,促进了结直肠癌的发生发展。
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