目的:多功能过氧化物酶(VP)是一种主要来源于侧耳菌属（Pleurotus）和烟管菌属(Bjerkandera)的可以氧化多种底物的氧化还原酶类。所以多功能过氧化物酶有很好的应用前景，它不但可以氧化木质素和染料，还可以氧化降解多种药物使其降解为无毒或低毒物质以减弱这些药物对环境和人体的危害。但是由于这种酶在氧化环境、高温环境及过酸过碱环境中极不稳定而限制其实际应用。多功能过氧化物酶的两个结构钙离子对于维持酶的活性和稳定性有很大的作用。参与构成多功能过氧化物酶两个钙离子结合区的氨基酸对酶的性质的影响，特别是针对近端钙离子结合区的相关研究较少。本研究拟通过对多功能过氧化物酶两个钙离子结合区氨基酸的定点突变来阐明其结构与稳定性的关系　　研究方法:在本研究中，将经密码子优化的多功能过氧化物酶基因克隆至pET-32a和pPICZαA表达载体中并在pET-32a载体上构建了多功能过氧化物酶两个钙离子结合区共9个氨基酸的定点突变体(D48A、G60S、D62A、S64A、S170A、D187A、T189A、V192T和D194A)。然后将pPICZαA-VP电转至毕赤酵母中以甲醇诱导表达并将野生型多功能过氧化物酶(pET-32a-VP)和各突变体转化至E.coliBL21(DE3)中在IPTG的诱导及血红素存在的条件下过表达并对其酶学相关性质进行检测，检测项目包括比酶活、酶反应动力学、酶反应的最适pH值、热稳定性、pH稳定性、钙离子含量及二级结构分析。比酶活的检测底物包括ABTS、RB5、VA及Mn2+。　　结果:1.经双酶切、菌落PCR及测序显示pPICZαA-VP、pET-32a-VP及各突变体构建成功。2.尽管尝试不同诱导表达条件，多功能过氧化物酶在毕赤酵母中的表达均未成功，SDS-PAGE分析显示无目的蛋白条带。3.多功能过氧化物酶及各突变体在E.coli中表达成功，经Ni柱纯化后得到高纯度的酶液。4.除了近端钙离子结合区的突变体S170A、S170D和V192T外，几乎所有的突变体都完全丧失活性。5.与野生型VP相比，S170A、S170D和V192T的最适pH值都从3.0偏移至3.5。6.WT VP、S170A、S170D及V192T的热稳定性和pH稳定性关系与其比酶活相类似:WT VP＞V192T＞S170A＞S170D。7.钙离子浓度检测显示，WT VP平均每个酶分子包含两个钙离子;而以S170A为代表的活性部分丧失的突变体平均每个酶分子含有1.5个钙离子;以D48A和D187A为代表的活性几乎完全丧失的突变体平均每个酶分子含有1.1个和0.7个钙离子。8.WT VP及其几个突变体的圆二色光谱结果显示，突变对蛋白的二级结构产生了一定的影响。　　结论:本研究首次阐明，多功能过氧化物酶对热的稳定性也与其近端钙离子有关。我们的研究清晰的显示，多功能过氧化物酶的酶活性、pH稳定性、热稳定性、钙浓度及二级结构与参与构成两个钙离子结合区的氨基酸之间存在着紧密联系。