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癌症严重影响人类的健康,是人类主要的死亡病因之一。根据国际癌症研究机构（IARC）的报告,预计到2030年全球癌症患者病例将达到2220万。目前治疗癌症的手段主要有手术治疗、放射治疗和化学治疗等,其中传统的化学治疗虽然取得一定的治疗效果,但仍存在疗效差、预后不良、毒副作用严重且易产生耐药性等缺点。癌症的突出特征是癌细胞的生长不受控制,进而破坏正常的组织及器官,使之功能紊乱、结构受损,最终影响机体的正常运转。近年来,药学工作者针对癌症发生发展中特异性表达的激酶、受体和细胞因子等研发新型靶向药物,以提高药物对癌细胞的选择性、安全性和耐受性,降低毒性,保证临床疗效。Aurora激酶和血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）是两类重要的癌症靶标分子。Aurora是一类丝/苏氨酸激酶,在中心体复制、纺锤体形成和染色体分配等有丝分裂过程关系密切,并参与调控PI3K/Akt/mTOR信号通路。VEGFR2作为重要的酪氨酸激酶受体,可诱导肿瘤血管生成,促进肿瘤侵袭和转移,参与调控Ras/Raf/MEK/ERK信号通路。目前,还没有Aurora激酶抑制剂用于临床治疗。虽然VEGFR2抑制剂索拉非尼、吉非替尼等在临床上有较好的应用,但仍存在抗肿瘤谱较窄、易产生耐药和毒副作用大等缺点。本课题组前期研究发现,化合物C0129和C0198具有较好的Aurora激酶抑制活性和抗肿瘤活性。同时发现,化合物C0129对VEGFR2也有显著的抑制活性。因此,本论文将对这两个化合物的体内外抗肿瘤活性及作用机制进行较为系统的研究。化合物C0129是一种稳定氮氧自由基标记的嘧啶类化合物,抑制Aurora A和VEGFR2的IC50分别为0.061 nM和1.469 nM。CCK-8法测得化合物C0129对结肠癌细胞HT-29、肝癌细胞HepG2、非小细胞肺癌细胞A549、宫颈癌细胞HeLa和前列腺癌细胞PC-3等都有较强的增殖抑制活性,IC50值分别为2.9?0.5μM、3.2?0.7μM、4.5?0.6μM、0.9?0.3μM和2.8?0.5μM,其中对HeLa细胞的抑制作用最强,对正常肾小球系膜细胞HRMC抑制不明显。此外,EdU实验表明在HeLa细胞中C0129可明显抑制细胞的DNA复制。在HeLa细胞中,一方面,通过免疫荧光实验发现C0129使纺锤体的形成受阻,影响细胞有丝分裂进程;细胞流式术和蛋白印迹分析发现C0129能够调控周期蛋白cdc2和cyclinB1的活性,使HeLa细胞周期阻滞在G2/M期;C0129还能够诱导细胞凋亡,使BAD、Bax、caspase-3以及caspase-9促凋亡蛋白上调,Bcl-2抑凋亡蛋白下调,调节PI3K/Akt/mTOR信号通路的传导。另一方面,C0129通过调控TGF-β、MMP2、MMP9和nm23-H1的表达,抑制HeLa细胞的迁移;C0129还通过调控FAK、VE-cadherin、YB-1以及p38MAPK蛋白的表达,减弱了HeLa细胞的侵袭能力。这些作用与C0129调控Ras/Raf/MEK/ERK信号通路有关。药代动力学研究表明C0129单次口服给药后其半衰期为4.12 h,达峰时间为4 h,而急性毒性实验显示其LD50大于1000 mg/kg;体内实验发现C0129在50 mg/kg时,体内对HeLa细胞移植瘤的抑瘤率为70%,高于VX680的50%;器官组织HE结果显示C0129在体内的毒性不明显,和急性毒性实验结果一致。综合上述结果,证明化合物C0129是一种Aurora A激酶和VEGFR2激酶受体双靶点抑制剂,体内外均具有较好的抗肿瘤活性,且有较好的成药性,具有进一步开发研究的价值。化合物C0198是一种酞嗪酮类Aurora激酶抑制剂,体外抑制Aurora A和Aurora B的IC50分别为118 nM和80 nM;在细胞水平能明显抑制结肠癌细胞HCT-116和LoVo、前列腺癌细胞PC-3、宫颈癌细胞HeLa和非小细胞肺癌细胞A549的活性,CCK-8法测得IC50值分别为0.83?0.2μM和2.2?0.7μM、1.75?0.6μM、3.2?0.5μM以及2.8?0.5μM;C0198对Aurora激酶高表达的HCT-116和PC-3肿瘤细胞的抗增殖活性最显著,而在正常肾小球系膜细胞HRMC中的毒性较小。在HCT-116细胞和PC-3细胞中,C0198通过阻滞细胞有丝分裂停滞在G2/M期,最终抑制了肿瘤细胞的增殖。C0198对肿瘤细胞周期的调控与它抑制Aurora A和Aurora B的活性直接相关。一方面,C0198通过抑制Aurora A在Thr288位的磷酸化,使Aurora A对CDC25B在Ser353位的磷酸化激活减弱,降低了CDC25B对cdc2/CyclinB1的调控作用;C0198通过抑制Aurora A的活性,使中心体的功能异常,导致纺锤体形成受阻,而微管蛋白是纺锤体的基本构成。另一方面,C0198通过抑制Aurora B在Thr232位的磷酸化,影响着丝粒的功能,引起染色体缺失和损坏,使染色体正常复制和分配紊乱,从而使纺锤丝连接并牵拉姐妹染色体的分离异常,最终染色体不能有序分配到子细胞中去,使细胞有丝分裂停滞在G2/M期。因此,C0198阻滞肿瘤细胞周期在G2/M期诱导细胞的死亡是抑制Aurora A和Aurora B激酶活性的结果。此外,体内急性毒性实验和药代动力学实验表明,C0198的LD50大于1000 mg/kg,半衰期为21 h,达峰时间为1.6 h,说明机体对C0198的吸收较快。裸鼠移植瘤实验发现C0198抑瘤作用显著,在HCT-116细胞移植瘤模型中,90 mg/kg C0198的抑制率为75%,高于VX680的60%;在PC-3细胞移植瘤模型中,90 mg/kg C0198的抑制率为66%,高于VX680的55%。组织器官HE结果显示,C0198对机体的器官损伤不明显,该结果和急性毒性结果一致。综上所述,C0198作为Aurora激酶泛抑制剂,在细胞水平和体内移植瘤水平均有显著的抗肿瘤活性,并且毒性较低,成药性较强,有进一步研究开发的价值。总之,本论文对本课题组发现的两种激酶抑制剂的抗肿瘤活性及其作用机制进行了较为详细的研究,为进一步研究开发奠定了较好的基础。