失眠是现代社会最常见的临床症状之一,严重影响人们的身体健康和生活质量,同时还会伴发多种躯体和精神疾病。现有的治疗药物不能满足临床的需要,因此,研发新型镇静催眠药具有重要意义。近年来,从药用植物中寻找新的治疗精神类疾病的成分已经成为一种趋势。大量研究表明,许多药用植物中的成分均具有疗效好,副作用小的特点,它们都可能作为先导化合物进行进一步的修饰而最终应用于临床。天麻是一种传统中药,具有安神、补益等功效。药理实验结果表明,天麻具有镇静催眠、抗惊厥、镇痛、促智、抗衰老和对心血管系统的保护作用。我们与中国医学科学院药物研究所植化室石建功教授合作,从天麻中分离得到一个单体化合物N6-(4-hydroxybenzyl)adenine riboside (NHBA),并以NHBA为先导化合物进行结构修饰,获得了一个新结构化合物B2。本论文研究了天麻活性成分NHBA及其类似物B2的镇静催眠作用,并对它们的作用机制进行了探索。腹腔注射给予化合物NHBA及B25min后,即可观察到小鼠出现明显的镇静现象。给药15min后,我们在小鼠自主活动模型和协同戊巴比妥钠睡眠模型上对NHBA及B2的镇静催眠活性进行评价。小鼠自主活动实验结果显示,与溶剂对照组相比,NHBA (1mg/kg, i.p.)可使小鼠的自主活动次数减少79%(p<0.01),B2(1mg/kg, i.p.)可使小鼠的自主活动次数减少93%(p<0.01)。协同戊巴比妥钠睡眠实验结果显示,与溶剂对照组相比,NHBA(1和5mg/kg, i.p.)可使小鼠的入睡潜伏期从4.6±0.3min分别缩短至3.8±0.1min (p<0.05)和3.2士0.1min(p<0.01),使小鼠的睡眠时间从42.2±1.9min分别延长至68.3±6.4min(p<0.05)和84.3±8.5min(p<0.01)；B2(1和5mg/kg, i.p.)可以使小鼠的入睡潜伏期从4.6±0.3min分别缩短至3.3±0.2min(p<0.05)和3.1±0.1min(p<0.01),使小鼠的睡眠时间从42.2±1.9min分别延长至99.1±9.2min(p<0.05)和106.3±9.2min(p<0.01)。协同阈下剂量戊巴比妥钠睡眠实验结果显示,与溶剂对照组相比,NHBA (1和5mg/kg, i.p.)及B2(1和5mg/kg, i.p.)均可显著增加小鼠的入睡只数。这些结果提示,NHBA及B2均具有良好的镇静催眠作用。我们进一步应用转棒试验、悬挂试验观察了NHBA及B2对小鼠肌肉张力、运动协调能力及体温的影响。转棒实验结果显示,给药20min后,与溶剂对照组相比,NHBA (5mg/kg, i.p.)组小鼠在转棒上的停留时间缩短19.1%,但无统计学差异；B2(1mg/kg, i.p.)可以使小鼠在转棒上的停留时间缩短67.1%(p<0.001)。悬挂实验结果显示,NHBA (5mg/kg, i.p.)及B2(1mg/kg, i.p.)均未表现出明显的肌松作用。体温观察结果显示,在给药20min后,与溶剂对照组相比,NHBA (5mg/kg, i.p.)及B2(1mg/kg, i.p.)能够使小鼠的体温降低1.9±0.1℃(p<0.001)和3.2±0.3℃(p<0.001)。这些结果提示,NHBA及B2无明显肌松作用,能够明显降低小鼠体温,引起小鼠的运动协调能力障碍。睡眠-觉醒是一个涉及多系统、多中枢的生理过程,具有复杂的神经调节机制。本研究在确认了NHBA及B2的镇静催眠作用的基础上,进一步对NHBA及B2镇静催眠的可能作用机制进行了探讨。1、腺苷是公认的内源性促睡眠因子,许多证据表明腺苷通过激动腺苷A1和A2A受体产生镇静催眠作用。有研究表明NHBA作为腺苷类似物与腺苷A2A受体有一定的亲和力,通过激动腺苷A2A受体对去血清损伤的PC12细胞产生明显的保护作用。我们实验室的前期实验结果显示,NHBA与腺苷A1和A2A受体均有一定的亲和力,Ki值分别是1.78μM和1.39μM；B2与腺苷A1和A2A受体也有一定的亲和力,Ki值分别是0.42μM和0.37μM。因此,我们拟观察NHBA和B2的镇静催眠作用是否是通过调动腺苷系统而产生的。我们应用HPLC-UV检测了NHBA及B2对脑组织内腺苷水平的影响,以及NHBA及B2对腺苷代谢关键酶——腺苷脱氨酶活性的影响,同时联合应用腺苷受体拮抗剂研究了NHBA及B2的催眠作用与腺苷A1和A2A受体的关系。结果显示,与溶剂对照组相比,NHBA (5mg/kg, i.p.)可使大鼠纹状体、脑干及丘脑组织的腺苷水平分别升高23.0%、14.7%和10.4%,对丘脑组织内的腺苷脱氨酶的活性无明显影响,腺苷A1受体拮抗剂DPCPX(0.2和0.5mg/kg,i.p.)及A2A受体拮抗剂SCH58261(0.2和1mg/kg, i.p.)都能够部分逆转NHBA (1mg/kg, i.p.)延长戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间的作用,但是对其缩短小鼠入睡潜伏期的作用无明显影响。提示腺苷A1及A2A受体可能都参与了NHBA的催眠作用。与溶剂对照组相比,B2(1mg/kg, i.p.)可使大鼠丘脑、脑干和纹状体组织的腺苷水平分别升高21.3%(p<0.05)、14.8%和12.4%,对丘脑组织内的腺苷脱氨酶活性无明显影响,腺苷A1受体拮抗剂DPCPX(0.2和0.5mg/kg, i.p.)及A2A受体拮抗剂SCH58261(0.2和1mg/kg, i.p.)能够部分逆转B2(0.5mg/kg, i.p.)延长戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间的作用,但是对其缩短小鼠入睡潜伏期的作用无明显作用。这些结果提示,B2发挥镇静催眠作用可能与升高脑内腺苷水平有关,但是其升高腺苷水平不是通过抑制腺苷脱氨酶的活性而产生的,同时腺苷A1及A2A受体也可能参与了B2的催眠作用。2、VLPO位于下丘脑前部,是重要的促睡眠中枢,通过释放GABA抑制促觉醒神经元而诱导睡眠。研究表明,腺苷可通过激动腺苷A1或A2A受体直接或者间接活化下丘脑睡眠中枢VLPO区,对睡眠-觉醒过程进行调节。我们的实验结果显示腺苷Al及A2A受体参与了NHBA和B2的催眠作用。因此,我们应用免疫组化的方法观察了NHBA及B2对睡眠中枢下丘脑腹外侧视前区GABA能神经元c-Fos的表达情况。GABA是中枢神经系统中一种重要的抑制性神经递质,参与睡眠-觉醒过程的调节,许多临床上使用的镇静药物和麻醉药都是通过增强GABA能的传递而发挥作用的。我们联合应用GABAA受体拮抗剂研究了NHBA及B2的催眠作用与GABAA受体的关系,应用HPLC-ECD检测了B2对脑组织内GABA及Glu水平的影响,应用氯离子敏感的荧光探针MQAE在原代培养的小脑颗粒神经元上观察了B2对氯离子流动情况的影响。结果显示,化合物NHBA (5mg/kg, i.p.)能够显著增加下丘脑腹外侧视前区GABA能神经元c-Fos的表达,GABAA受体拮抗剂印防己毒素(2mg/kg, i.p.)不能够拮抗NHBA(2和5mg/kg, i.p.)的催眠作用。这些结果提示,NHBA通过兴奋睡眠中枢GABA能神经元发挥镇静催眠作用,但是GABAA受体不是其发挥作用的靶点。化合物B2(1mg/kg, i.p.)能够显著增加下丘脑腹外侧视前区GABA能神经元c-Fos的表达,GABAA受体拮抗剂印防己毒素(1和2mg/kg, i.p.)能够拮抗B2(15mg/kg, ig)的催眠作用,而GABAA受体拮抗剂荷包牡丹碱(2和4mg/kg, i.p.)和氟马西尼(3.5和7mg/kg, i.p.)则对B2(15mg/kg,ig)的催眠作用未产生明显拮抗作用,B2(1mg/kg, i.p.)能够使脑组织谷氨酸水平降低6.0%(p<0.05),但对GABA水平无明显影响。在原代培养的大鼠小脑颗粒神经元上应用氯离子敏感的荧光探针MQAE进行的氯离子流动实验结果表明,在低氯缓冲液环境下,相比溶剂对照组,B2在3×10-6和3×10-5mol/L浓度下可使氯离子外流增加91.1%(p<0.05)和113.7%(p<0.01)。这些结果提示,化合物B2可能通过兴奋睡眠中枢VLPO区的GABA能神经元,同时激动GABAA受体而发挥镇静催眠作用。3、睡眠-觉醒状态的稳定转换是通过VLPO区神经元和去甲肾上腺素能促觉醒系统之间的相互抑制而产生的。我们应用HPLC-ECD检测了NHBA及B2对脑组织内单胺类神经递质NA水平的影响,结果显示,NHBA (5mg/kg, i.p.)可使大鼠下丘脑和脑干组织内NA水平分别降低12.7%(p<0.01)和9.1%(p<0.05),B2(1mg/kg, i.p.)可使大鼠下丘脑和脑干组织内NA水平分别降低23.6%(p<0.001)和14.8%(p<0.01)。结果提示NHBA及B2引起NA水平的下降可能也是其发挥镇静催眠作用的机制之一。