人类疾病致病基因的发现为我们理解疾病发病机理的分子机制提供了很好的途径。寻找致病基因最常用的方法是定位克隆,现代生命科学领域最强有力的研究手段之一。定位克隆在寻找人类致病基因方面已经取得了很大成功,超过30种心血管疾病的疾病基因都是通过定位克隆的方法发现的。定位克隆同样对医学领域产生了革命性的影响,致病基因的发现不仅为理解疾病的分子机理和人类基因的功能提供了很好的帮助,而且为疾病诊断技术的发展和指导基因针对性治疗做出了很大的贡献,致病基因的功能研究也将为理解疾病的发病机理和疾病的诊断提供理论基础,并促进我们对基因的结构和功能的认识,本研究通过定位候选克隆的方法,在遗传性牙本质发育不全、先天性眼外肌纤维化、长QT综合症(LQTS)等疾病的病人中发现了致病基因的多个突变,同时通过生物化学、分子生物学、细胞生物学方法,基因敲除小鼠动物模型对新的房颤致病基因进行了功能研究。第一部分:Ⅱ型牙本质发育不全致病基因新突变的发现遗传性牙本质缺陷分为两种主要类型:牙本质发育异常(Ⅰ型和Ⅱ型)和牙本质发育不全(Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型)。Ⅱ型牙本质发育不全是最常见的一种牙本质缺陷疾病,以常染色体显性方式遗传。到目前为止,DSPP基因是唯一一个被发现的牙本质发育不全的致病基因。我们发现并鉴定了一个有四代成员的Ⅱ型牙本质发育不全的中国人家系,家系共有18位成员,包括8个患者。用DSPP基因两侧的微卫星遗传标记D4S1534和D4S414做连锁分析发现,DSPP基因与疾病连锁。家系中患者的DSPP基因的5个外显子包括内含子、外显子的交界处直接测序,发现在DSPP基因的第一个外显子有一个新的突变(c.49C→T,p.Pro17Ser)。Pro17Ser突变是一个突变热点,它是成熟的DSP蛋白的第二个氨基酸,第17位脯氨酸在进化上高度保守,家系中的所有患者都携带这个突变,但家系中的正常个体和100个正常对照个体不携带这个突变。结果表明在这个家系中DSPP基因的Pro17Ser突变导致Ⅱ型牙本质发育不全,我们的研究发现了DSPP基因的一个新突变,拓展了对DSPP基因导致牙本质发育不全的认识。第二部分:KIF21A基因的p.Arg954Trp突变引起中国人先天性眼外肌纤维化Ⅰ型先天性眼外肌纤维化(Congenital fibrosis of the extraocular muscles,CFEOM)是一种罕见的常染色体显性遗传的眼肌疾病,临床上主要表现为动眼神经缺陷而引起的斜视。在本研究中,我们鉴定了一个有四代病人的CFEOM1家系,连锁分析表明致病基因与染色体12q处的微卫星标记D12S85紧密连锁,最大Lod值为2.1。对D12S85附近的CFEOM1致病基因KIF21A进行突变检测,在KIF21A基因第21个外显子发现有一C→T的碱基替换,该变化引起KIF21A基因的第954位密码子由精氨酸突变为色氨酸,SSCP分析结果表明该家系中的所有患者都具有这一突变,而在家系中的所有正常人以及150个正常汉人对照中则不能检测到这一改变。我们的研究表明KIF21A p.Arg954Trp突变是引起这一先天性眼外肌纤维化家系病人患病的致病原因。第三部分:LQTS(LQTS)家系中KCNH2基因新突变和KCNH2 K897T多态保护效应的发现KCNH2导致长QT综合症(LQTS)最常见的钾通道致病基因之一,LQTS是以心电图上QTc的延长为特征并伴有猝死的一种心律失常疾病。在散发的LQTS人群中,我们发现KCNH2一个新的突变2020insAG,在一个LQTS家系中,我们发现KCNH2基因A490T突变与KCNH2基因的K897T单核苷酸多态共分离。同时携带KCNH2 A490T突变与K897T单核苷酸多态的患者和携带KCNH2 R366X突变的LQTS患者都有心动过缓的症状。有报道KCNH2 K897T单核苷酸多态对QTc有修饰作用(KCNH2 K897T单核苷酸多态影响QTc),但是K897T是充当风险因子还是具有保护作用还有争议。我们发现在家系中,7个同时携带A490T突变和K897T的T等位基因的患者比只携带A490T突变或A490P突变的患者有更短的QTc并有更轻的症状,这些结果表明KCNH2 K897T单核苷酸多态对QTc的延长起保护作用。第四部分:核孔蛋白基因NUP155突变导致房颤房颤是一种最常见的一种心律失常疾病,我们在以前的研究中通过全基因组连锁分析发现一个新的房颤致病基因的位点位于染色体5p13。通过对连锁区域内的所有候选基因进行突变筛选,我们发现新的房颤致病基因是NUP155。NUP155基因编码一种分子量为155kDa的核孔蛋白,核孔蛋白是核孔复合物的一种重要成分。我们研究发现,在这个房颤家系中,NUP155基因的的纯合突变R391H与房颤共分离,进一步的细胞生物学研究发现R391H突变影响NUP155蛋白的核定位。NUP155蛋白在小鼠的心房心肌细胞中大量表达。纯合子的NUP155基因敲除小鼠死于胚胎发育的8.5天前,但是杂合子的NUP155基因敲除小鼠有房颤表型。对人和小鼠的研究都表明NUP155基因的功能丧失导致房颤,我们首次发现核孔蛋白复合体成分的突变导致心血管系统疾病。这些结果提供了房颤的新的非离子通道的遗传学基础,提出了房颤发病机理的一种新的机制,也为房颤的治疗和诊断提供了新的潜在靶标。