登革病毒（Dengue virus,DENV）是黄病毒科黄病毒属中一重要成员，基于核苷酸序列差异可被分为四个血清型（DENV1，2，3，4）。DENV每年可导致全球4亿人感染，2万人死亡。DENV特异性抗体可为DENV感染诊断和疫情防控提供支持。DENV的表面抗原E蛋白是介导病毒感染宿主细胞的主要抗原，其胞外区分为三个结构域（Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ区），E蛋白Ⅲ区又是DENV诱导抗体尤其是中和抗体的重要靶位。
　　本项目拟合成编码登革病毒2型E蛋白Ⅲ区（DENV2-EDⅢ）的核苷酸序列并克隆入原核表达载体pET21a。用大肠杆菌表达的DENV2-EDⅢ免疫小鼠，将免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞。采用ELISA筛选可产生靶向DENV2-EDⅢ的阳性杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，采用蛋白G柱从小鼠腹水中纯化抗体IgG。采用间接免疫荧光实验，SDS-PAGE电泳和体外中和实验评估所制备单抗识别DENV特性及中和DENV感染的能力。
　　实验目的：
　　1.制备靶向DENV2-EDⅢ的小鼠源性单克隆抗体；
　　2.探讨所制备单克隆抗体体外识别，中和DENV的作用。
　　实验方法：
　　1.DENV2-EDⅢ的原核表达：
　　合成编码DENV2-EDⅢ的基因序列（两端带限制性核酸内切酶位点），经双酶切后连接入原核表达质粒pET21a。重组质粒转化入大肠杆菌BL21。采用SDS-PAGE电泳和WB实验鉴定诱导表达的蛋白。采用镍亲和层析柱纯化诱导表达的DENV2-EDⅢ。
　　2.杂交瘤细胞制备：
　　DENV2-EDⅢ免疫小鼠，小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞融合成杂交瘤细胞。采用ELISA和间接免疫荧光实验筛选可产生靶向DENV2-EDⅢ的阳性杂交瘤细胞。
　　3.单克隆抗体制备及体外功能研究：
　　将上述阳性杂交瘤细胞注入小鼠腹腔。采用蛋白G柱从小鼠腹水中纯化抗体IgG。基于DENV四个血清型感染的Vero细胞采用间接免疫荧光实验评估所制备单抗检测DENV感染的作用。基于Vero细胞采用微中和实验评估所制备单抗中和DENV感染的效应。
　　实验结果：
　　1.构建出了表达DENV2-EDⅢ的重组质粒pET21a-DENV2-EDⅢ，在大肠杆菌BL21中表达出了DENV2-EDⅢ，其得到了SDS-PAGE电泳和WB实验的验证。
　　2.重组表达的DENV2-EDⅢ在小鼠体内具有免疫原性，ELISA实验证实其免疫小鼠诱导产生了抗体反应。
　　3.制备出3株产靶向DENV2-EDⅢ的单克隆抗体的杂交瘤细胞，通过小鼠腹水产生法所获得的单克隆抗体即可识别DENV2感染的细胞，也可交叉识别DENV1，3，4感染的细胞；而且所获得的单克隆抗体体外对DENV四个血清型的感染具有中和作用。
　　实验结论：
　　制备出了3株杂交瘤细胞，其产生的单克隆抗体可检测4种登革病毒血清型的感染，对4种登革病毒血清型有中和作用。