论文部分内容阅读
背景:肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）在世界范围内是致死率第三位的恶性肿瘤。由于早期缺少典型的临床症状和敏感的诊断指标,多数HCC在进展期被诊断出来,具有较差的预后。因此,新的HCC诊断标志物和治疗靶点的研究非常重要。环状RNA（Circular RNA,CircRNA）是一类非编码RNA,近年来它们被发现参与到了多种疾病的发生发展过程中。目的:本研究的目的在于通过定量检测并比较circRNAhsacirc 0001445和circSMD2在HCC和癌旁组织:在HCC、肝硬化、乙型病毒肝炎（乙肝）患者及健康人群血浆中的RNA表达水平,寻找变化规律并确定其对HCC的诊断价值。接着,探索circSMAD2在HCC细胞中的生物学功能,并进一步地研究其分子机制。此外,检测比较Homer2在HCC和癌旁组织中的表达量,并评估组织中Homer2的表达量对HCC的诊断价值,并制备抗Homer2单克隆抗体。方法:收集了 HCC癌和癌旁组织;HCC、肝硬化和乙肝患者及健康对照的血浆,利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测组织和血浆中的circRNA hsacirc0001445和circSMAD2的表达量,绘制受试者特征（ROC）曲线评估其对HCC的诊断价值。接着,首先通过qRT-PCR的方法对HCC细胞株和正常肝细胞中的circSMAD2的表达量进行检测。然后通过重组表达circSMAD2的质粒pcDNA3.1（+）-circSMAD2,并转染HCC细胞株HepG2。接着,通过增殖、凋亡、迁移、侵袭和western blot实验研究过表达circSMAD2对HCC细胞生物学活动的影响。进而通过生物信息学的方法预测circSMAD2的靶miRNA,并重组了野生型的psiCHECK-circSMAD2-wt载体,并通过点突变的方式,获得了其与靶miRNA结合位点突变的载体psiCHECK-circSMD2-mut,并通过双荧光素酶报告实验的方法来验证二者直接结合的关系。此外,通过过表达和敲低circSMAD2来研究其对靶miRNA表达的影响。最后,通过验证共转染circSMAD2和靶miRNA对HCC细胞的影响来探索circSMAD2调节HCC的分子机制。最后,使用qRT-PCR的方法对79对HCC患者的癌和癌旁组织中Homer2的表达量进行了研究,并使用ROC曲线评价了其对HCC的诊断价值。通过克隆、重组、表达和纯化等方法获得Homer2免疫蛋白和筛选蛋白。并进行小鼠的免疫、细胞的融合、杂交瘤细胞的筛选、腹水的获得及抗体的纯化等实验制备抗Homer2单克隆抗体,并通过间接ELISA和western blot验证其特异性。结果:HCC组织中hsacirc0001445（P<0.001）和circSMAD2（P=0.014）的表达量均显著低于癌旁组织,并且hsacirc0001445的表达量和癌灶数量相关（P =0.014）,而circSMAD2的表达量和癌组织的分化程度相关（P<0.001）。还发现HCC患者血浆hsacirc0001445水平明显低于肝硬化（P<0.001）、乙肝（P<0.001）和健康对照（P<0.001）的水平。ROC曲线显示血浆hsacirc001445是一个良好的诊断指标并能很好地区分HCC与健康对照（AUC=0.862）、肝硬化（AUC=0.672）或乙肝（AUC=0.764）患者,与血清AFP联合应用时,血浆hsa-circ0001445的诊断价值进一步提高。接着,细胞生物学功能实验证明过表达circSMAD2可以抑制HCC细胞的迁移、侵袭和上皮间质转换（EMT）。进一步地,通过生物信息学的预测了潜在的circSMAD2的靶点,选择了其中评分前十位的miRNA合成了 miRNAmimics,通过双荧光素酶报告实验证明其中miR-629可以直接结合circSMAD2。此外,我们发现在HCC细胞株中过表达circSMAD2可以抑制miR-629的表达,反之亦然。在HCC细胞株中共转染circSMAD2和miR-629可以抑制过表达circSMAD2对HCC细胞迁移、侵袭和EMT的调节。此外,Homer2在癌组织中的表达量显著降低（P<0.001）,并且对HCC具有一定的诊断价值（AUC=0.660）。此外,通过克隆、重组、表达和纯化获得了高纯度的Homer2免疫蛋白和筛选蛋白,然后通过细胞融合的方法得到了稳定分泌抗Homer2抗体的杂交瘤细胞株,并且通过腹水纯化的方法制备出了特异性的抗Homer2单克隆抗体,命名为Anti-Homer2-2B7。间接ELISA和Western blot证明其具有良好的特异性。结论:hsacirc0001445和circSMAD2在HCC中的表达量均显著降低,并且血浆hsacirc0001445水平对HCC具有良好的诊断价值。并且,circSMAD2可以通过调节miR-629的功能来抑制HCC细胞的迁移、侵袭和EMT。此外,Homer2在HCC组织中的表达量显著降低并对HCC具有一定的诊断价值。最后,本研究成功制备了特异性的抗Homer2单克隆抗体。