论文部分内容阅读
蛇毒是一种含多种成分的复杂混合物，其中的降纤成分主要有两类：类疑血酶和金属蛋白酶。蛇毒类凝血酶属蛇毒丝氨酸蛋白酶(SVSP)炎，迄今，已有7种蛇毒类凝血酶被制成商品出售，并已成为临床上防治血栓性疾病的有效药物；其中Ancrod和Botroxobin等类凝血酶基因相继被克隆、测序。蛇毒金属蛋白酶(SVMP)是蛇毒中另一类具有降解纤维蛋白(原)活性的蛋白酶，具有底物高度专一性、热稳定性和半衰期长作用持久的特点，是一种具有潜在应用价值的强力溶栓剂；国外已有将此类酶成功克隆并表达的报道。 国产蝮蛇栓酶中以清栓酶(从东北长白由地区的腹蛇毒中提取制务)对血栓形成的抑制率(63％)为最高，但对其中的类凝血酶及金属蛋白酶的氨基酸及基因全序列至今尚未报道。 本文旨在利用分子生物学技术，从东北长白山白眉蝮蛇毒腺中克隆出类凝血酶和隆纤酶的基因序列，并推导出其氨基酸序列，将其基因在原核和真核表达体系中进进重组表达，探索最佳表达纯化方式，以满足基础和临床的研究。 首先，用一步法Oligo(dT)-纤维素柱层析的方法，分离提取蛇毒腮腺组织的总RNA和mRNA，反转录合成cDNA的一、二链，经水端连接含EcoR Ⅰ的衔接子后克隆于λgt-11载体，构建蛇毒腮腺组织的cDNA文库，滴度为6.3×10~6pfu／ml，重组率为97.85％，平均插入片段在1.2 Kb以上。 第二，根据蛇毒丝氨酸蛋白酶(SVSP)和金属蛋白酶(SVMP)基因序列非翻译区的高度保守性，合成兼并引物，以构建cDNA文库为模板，用PCR方法分别扩增出800bp、1300bp大小的片段，克隆于T载体后，挑取阳性克隆，测序得到三种K度为786bp、774bp和1233bp且具有完整阅读框架的DNA序列，分别编码262、258和411个氨基酸残基。其中两种属于SVSP，分别命名为Brestelobin-1