论文部分内容阅读
胶质瘤(Glioma)是颅内最常见的原发性恶性肿瘤,其中恶性程度最高的是胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM,WHOⅣ级)。目前胶质瘤的治疗效果欠佳,GBM患者的中位生存时间仅仅有1年。尽管手术切除为主,结合放疗和化疗的综合治疗方法得到了广泛应用,GBM病人的预后结果仍然难以让人满意,绝大多数患者仍会在术后短时间内复发。为了提高胶质瘤患者的治疗效果,在基因和分子水平上探讨肿瘤的发生机制成为了当务之急。近年来,大量的lncRNAs在人类基因组的转录本中被发现;并且研究表明其在包括肝癌、胃癌、肾癌、结直肠癌、胶质瘤等在内的多种人类肿瘤的发生发展中发挥有重要的生物调节功能;一些lncRNAs的异常表达与胶质瘤患者的复发及预后密切相关;在lnc RNA的研究领域,人们对其功能及作用机制尚知之甚少;了解lnc RNA在胶质瘤发生发展中的功能及其分子调节机制有助于我们寻找新的胶质瘤治疗靶点及分子诊断标志物。我们利用基因表达谱芯片技术,通过检测5例正常脑组织样本和5例胶质母细胞瘤组织样本中基因表达的差异,初步构建了脑胶质瘤的基因表达谱芯片数据库,并通过对其进行生物信息学分析,筛选出在胶质瘤中差异表达并可能在其发生发展中起关键作用的lnc RNA。HOXD基因簇反义链RNA 2(HOXD-AS2,HOXD cluster antisense RNA 2)即是其中之一。HOXD-AS2定位于人染色体2q31.1,全长692bp,是Homeobox D基因的反义链。芯片数据提示其在胶质母细胞瘤中的表达明显高于正常脑组织。本研究重点对长链非编码基因HOXD-AS2进行探索。首先,选取HOXD-AS2基因及另外5条随机抽取的基因,利用RT-PCR技术,在用作建立基因表达谱芯片数据的5例胶质母细胞瘤组织标本和5例正常脑组织标本中验证芯片数据的可靠性。结果发现,RT-PCR的检测结果同基因芯片的数据存在良好的一致性,HOXD-AS2基因在胶质母细胞瘤中的表达明显高于正常脑组织。然后进一步扩大样本验证,在45例低级别胶质瘤和57例高级别胶质瘤中检测HOXD-AS2基因的表达量,观察其表达与胶质瘤病理级别及其他临床指标的相关性,并分析HOXD-AS2基因的表达水平与患者临床预后的关系。最后,利用小干扰RNA技术在胶质瘤细胞株U251中特异性地干扰HOXD-AS2基因的表达,观察其对胶质瘤细胞株U251生长、增殖、凋亡、侵袭等细胞恶性表型的影响。第一部分长链非编码基因HOXD-AS2在脑胶质瘤中的表达及其与临床预后的关系目的:研究HOXD-AS2基因在正常脑组织、不同级别脑胶质瘤组织中的表达水平,并分析其与患者临床预后的关系。方法:应用Real-time PCR技术检测5例胶质母细胞瘤组织标本和5例正常脑组织标本中HOXD-AS2基因的表达情况。然后扩大样本量,在8例I级、37例II级、24例III级、33例IV级胶质瘤临床标本中检测HOXD-AS2基因的表达量,观察其与胶质瘤病理分级的关系;同时纳入患者年龄、性别、肿瘤大小、手术切除程度等临床指标,观察HOXD-AS2基因的表达情况(+,++,+++)与患者临床指标的相关性。并根据HOXD-AS2基因的表达情况,将I-IV级胶质瘤中临床资料完整的共87例患者分为高表达组和低表达组,随访患者生存时间,通过Kapian-Meier Survival Curve法,观察HOXD-AS2基因表达水平与患者生存期的关系。将I、II级共40例肿瘤纳入低级别肿瘤组,III、IV级共47例肿瘤纳入高级别肿瘤组,用同样的方法分别在低级别肿瘤组(I+II级)和高级别肿瘤组(III+IV级)进行生存分析,在两个亚组内进一步观察HOXD-AS2基因表达水平与患者生存期的关系。结果:Real-time PCR结果提示正常脑组织及I、II、III、IV级胶质瘤中HOXD-AS2/GAPDH的相对表达值分别为0.0073±0.0046,0.0519±0.0514,1.3477±2.2276,1.9717±2.9306和1.8884±3.1063,正常脑组织和各级别肿瘤基因表达量之间的差异具有统计学意义(p<0.05);正常脑组织、低级别胶质瘤(I+II级)和高级别胶质瘤(III+IV级)中HOXD-AS2/GAPDH的相对表达值分别为0.00733±0.00460、1.142±2.060和1.924±3.039,正常脑组织和低级别肿瘤之间、正常脑组织和高级别肿瘤之间,以及低级别肿瘤和高级别肿瘤之间基因表达量的差异均有统计学意义(p<0.05)。用卡方检验和Fisher精确概率法观察HOXD-AS2基因表达水平与患者年龄、性别、肿瘤大小、手术切除程度、病理级别的相关性发现,HOXD-AS2基因表达水平仅与肿瘤的病理级别有关(p=0.003)。用K-M法和Log-rank检验进行生存分析发现HOXD-AS2高表达组中位总体生存时间明显短于HOXD-AS2低表达组(分别为16个月和42个月,p=0.007)。亚组分析发现,这种差异在低级别胶质瘤组(I+II级)更加明显。结论:HOXD-AS2基因在脑胶质瘤中的表达水平较正常脑组织明显升高,并且其表达水平与肿瘤的级别相关,高级别胶质瘤中的表达高于低级别胶质瘤。HOXD-AS2基因高表达是胶质瘤患者,尤其是低级别胶质瘤患者,预后不良的危险因素。第二部分敲减长链非编码基因HOXD-AS2表达后对脑胶质瘤细胞株U251细胞功能的影响目的:研究通过小干扰RNA(siRNA)抑制HOXD-AS2表达后对脑胶质瘤细胞株U251细胞功能的影响。方法:采用siRNA干扰技术,以Lipofectamin3000作为转染载体,在U251细胞株中特异性地敲减HOXD-AS2的表达,观察其对U251细胞增殖、凋亡、细胞周期以及迁移、侵袭能力的影响。对照组分别用U251细胞+Lipofectamin3000空载体(Mock,M)、U251细胞+Lipofectamin3000载体+非特异性寡核肽(Negative Control,NC)作为空白对照(M)、阴性对照(NC)。实验组根据HOXD-AS2的不同基因位点,设计并合成出3条特异性siRNA,以Lipofectamin3000作为转染载体,在U251细胞株中特异性地敲减HOXD-AS2的表达。采用Real-time PCR技术分别在转染后的48hr检测HOXD-AS2的表达水平,从而筛选出干扰效率最高的一条siRNA。用此siRNA作为干扰序列,CCK8法、EDU细胞增殖实验检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期分布情况及凋亡情况,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell小室法检测细胞侵袭能力的改变情况。结果:在干扰U251细胞中HOXD-AS2表达后第48小时,CCK8法及EDU细胞增殖实验均提示干扰细胞株的增殖能力较NC组下降(p<0.05);干扰后48小时,经流式细胞仪检测发现,实验组U251细胞株较NC组细胞周期中处于增殖期(S期+G2期)的细胞数目减少(p<0.05),细胞周期发生阻滞;流式细胞仪测凋亡发现凋亡细胞比例未见显著变化(p>0.05);划痕实验提示干扰HOXD-AS2表达后36小时和72小时,U251细胞的迁移能力显著下降(p<0.05);Transwell小室法检测细胞侵袭能力未见显著变化(p>0.05)。结论:在胶质瘤细胞株U251中敲减HOXD-AS2表达后可使细胞周期发生阻滞,降低细胞增殖能力,同时可使细胞的迁移能力显著下降,对细胞的侵袭能力未见显著影响。