论文部分内容阅读
目的:本团队前期研究发现针刺CFA(Complete Freund’s Adjuvant,完全弗氏佐剂)诱导的AIA(Adjuvant Induced Arthritis,佐剂性关节炎)炎性痛大鼠双侧足三里可升高血液中CXCL1(The chemokine(C-X-C motif)ligand 1,趋化因子CXC配体1)含量,且血液中CXCL1参与针刺镇痛,同时脊髓中CXCL1含量也升高。本研究在针刺双侧足三里对AIA大鼠镇痛有效的平台上,旨在探究针刺足三里上调AIA大鼠血液中CXCL1是否作用于脊髓发挥镇痛作用,并阐明脊髓中CXCL1及其受体CXCR2(The chemokine(C-X-C motif)receptor 2,趋化因子CXC受体2)介导针刺镇痛的作用机制,以期为针刺抗炎性痛提供实验依据。方法:1.针刺对脊髓CXCL1蛋白和基因含量的影响:采用0.1ml CFA右侧足底皮内注射,建立CFA诱导的AIA炎性痛模型,观察针刺双侧足三里对AIA大鼠造模侧热辐射痛的影响;在针刺第7天后取脊髓,采用ELISA方法检测脊髓CXCL1含量的变化,采用RT-q PCR方法检测脊髓CXCL1m RNA含量的变化,采用免疫荧光染色的方法检测脊髓背角CXCL1的平均荧光强度。2.血液CXCL1的作用器官筛查:利用小动物活体成像技术,采用染料Alexa Fluor750(AF750)标记CXCL1重组蛋白,经尾静脉注入大鼠体内,通过Perkin Elmer3D小动物活体成像仪,实时动态观测血液中CXCL1增高后在全身的富集部位,尾静脉注射后即刻及活体观测结束后解剖取大鼠各器官进行离体观测。3.调控脊髓CXCL1介导针刺镇痛效应:采用鞘内注射CXCL1中和抗体及CXCL1重组蛋白,不同程度的降低针刺组脊髓中CXCL1含量,或升高模型组脊髓中CXCL1浓度,观察对热辐射痛及脊髓致痛因子COX2含量的影响。4.脊髓CXCL1-CXCR2脱敏参与针刺镇痛机制:采用ELISA方法检测脊髓部位全蛋白及膜蛋白CXCR2的含量、下游致痛物质COX2(Cyclo-oxygen-ase 2,环氧和酶2)和PGE2(Prostaglandin E2,前列腺素E2)的含量;采用RT-q PCR方法检测脊髓部位CXCR2m RNA含量的变化;采用免疫荧光方法检测脊髓背角CXCR2含量的变化;采用免疫荧光双标的方法将CXCL1、CXCR2分别与星形胶质细胞标记物GFAP、神经元细胞的标记物Neu N共染,确定CXCL1及CXCR2在脊髓的表达细胞;采用Western-Blot检测脊髓脱敏蛋白GRK2(G protein-coupled receptor kinase 2,G蛋白偶联受体激酶2)、GRK6(G protein-coupled receptor kinase 6,G蛋白偶联受体激酶6)、β-Arrestin1/2(Beta-Arrestin1/2,抑制蛋白β-Arrestin1/2)含量变化。探索针刺调控CXCL1-CXCR2信号通路的镇痛机制。结果:实验一:针刺双侧足三里可改善AIA大鼠炎性痛,发现针刺上调的脊髓CXCL1主要来源于血液。1.针刺具有镇痛效应:造模后,模型组大鼠相对于盐水组足底热辐射痛阈值降低(P<0.01);针刺可升高造模侧热辐射痛阈值,从针刺第一天起效(P<0.01),一直持续到第7天(P<0.01);提示针刺可改善AIA大鼠炎性痛。2.脊髓CXCL1蛋白含量的变化:与盐水组相比,模型组CXCL1含量升高,有统计学差异(P<0.05),针刺组CXCL1含量升高,有显著统计学差异(P<0.01);与模型组相比,针刺组CXCL1含量升高,有显著统计学差异(P<0.01);提示针刺可上调脊髓CXCL1蛋白含量。3.脊髓背角CXCL1平均荧光强度:与盐水组比较,模型组及针刺组CXCL1平均荧光强度升高,有显著统计学差异(P<0.01);与模型组比较,针刺组CXCL1平均荧光强度升高,有显著统计学差异(P<0.01);提示针刺可上调脊髓背角CXCL1蛋白含量。4.脊髓CXCL1 m RNA含量的变化:与盐水组相比,模型组和针刺组CXCL1 m RNA含量升高,模型组未见统计学差异(P>0.05),针刺组有统计学差异(P<0.05);与模型组比,针刺组CXCL1 m RNA有升高趋势,未见统计学差异(P>0.05)。提示针刺对脊髓产生CXCL1影响较小。5.小动物活体成像结果:血液中升高的CXCL1可随血液循环通过血-脊髓屏障及血脑屏障进入脊髓与脑,脊髓中升高的CXCL1部分来源于血液中的CXCL1;提示血液CXCL1可进入中枢神经系统。实验二:脊髓CXCL1介导针刺镇痛效应6.中和脊髓CXCL1的调控结果:(1)足底热辐射痛阈值:与针刺组相比,针刺+低剂量CXCL1中和剂组第一天针刺后1h、6h、20h及第二天针刺后1h均降低,且有显著统计学差异(P<0.01);针刺+高剂量CXCL1中和剂组第一天针刺后1h、6h、20h均变化不大,无统计学差异(P>0.05),第二天针刺后1h降低有统计学差异(P<0.05)。(2)脊髓致痛因子COX2:与模型组比较,针刺组、针刺+高剂量CXCL1中和剂组COX2含量下降,有统计学差异(P<0.05);与针刺组比较,针刺+低剂量CXCL1中和剂组COX2含量上升,有显著统计学差异(P<0.01),针刺+高剂量CXCL 1中和剂组COX2含量变化不明显,未见统计学差异(P>0.05);提示低剂量CXCL1中和抗体可明显拮抗针刺镇痛效应。7.重组脊髓CXCL1的调控结果:(1)足底热辐射痛值:与模型组比较,模型+低剂量CXCL1重组蛋白组第一天针刺后1h、6h、20h变化不明显,无统计学差异(P>0.05),第二天针刺后1h降低,有统计学差异(P<0.05);模型+高剂量CXCL1重组蛋白组第一天针刺后1h升高有显著统计学差异(P<0.01),第一天针刺后6h升高,有统计学差异(P<0.05),第一天针刺后20h升高无统计学差异(P>0.05),第二天针刺后1h升高,有统计学差异(P<0.05)。(2)脊髓致痛因子COX2:与模型组比较,模型+高剂量CXCL1重组蛋白组,COX2含量有下降趋势,但无统计学差异(P>0.05);与针刺组比较,模型+重组蛋白高剂量组COX2含量上升,有统计学差异(P<0.05);提示高剂量CXCL1重组蛋白可模拟针刺镇痛效应。实验三:针刺升高脊髓CXCL1可能促使脊髓CXCR2受体脱敏8.针刺具有镇痛效应:造模后,模型组大鼠相对于盐水组足底热辐射痛阈值降低(P<0.01);针刺可升高造模侧热辐射痛阈值,从针刺第一天起效,一直持续到第7天,针刺第1-5天有统计学差异(P<0.05),第6-7天有显著统计学差异(P<0.01);提示针刺可改善AIA大鼠炎性痛。9.脊髓全蛋白CXCR2的变化:与盐水组相比,模型组和针刺组CXCR2含量升高,有显著统计学差异(P<0.01);与模型组比,针刺组CXCR2含量降低,有统计学差异(P<0.05);提示针刺可下调脊髓全蛋白CXCR2的含量。10.脊髓膜蛋白CXCR2的变化:与盐水组相比,模型组和针刺组CXCR2升高,模型组有显著统计学差异(P<0.01),针刺组无统计学差异(P>0.05);与模型组比,针刺组CXCR2降低,有显著统计学差异(P<0.01);提示针刺可下调脊髓膜蛋白CXCR2的含量。11.脊髓背角CXCR2的平均荧光强度:与盐水组比较,模型组CXCR2平均荧光强度升高,有显著统计学差异(P<0.01);针刺组平均荧光强度变化不明显;与模型组比较,针刺组CXCR2平均荧光强度下降,有统计学差异(P<0.05);提示针刺可下调脊髓背角CXCR2的含量。12.脊髓CXCR2m RNA的变化:与盐水组相比,模型组和针刺组CXCR2m RNA升高,均有显著统计学差异(P<0.01);与模型组比,针刺组CXCR2m RNA降低,未见统计学差异(P>0.05);提示针刺对脊髓产生CXCR2影响较小。13.脊髓CXCL1及CXCR2的表达细胞:CXCL1与星形胶质细胞(GFAP)及神经元细胞(Neu N)均有共染;CXCR2与神经元细胞(Neu N)有共染,与星形胶质细胞(GFAP)没有共染;提示脊髓星形胶质细胞、神经元细胞表达CXCL1,神经元细胞表达CXCR2。14.脊髓脱敏蛋白的变化:与盐水组比,针刺组GRK2、GRK6、β-Arrestin1/2升高,未见统计学差异(P>0.05),与模型组比,针刺组GRK2、β-Arrestin1/2升高,未见统计学差异(P>0.05),针刺组GRK6未升高(P>0.05);提示针刺不影响脊髓脱敏蛋白的含量。15.脊髓致痛因子COX2、PGE2的变化:(1)与盐水组相比,模型组和针刺组COX2升高,模型组有显著统计学差异(P<0.01),针刺组未见统计学差异(P>0.05);与模型组比,针刺组COX2降低,有显著统计学差异(P<0.01)。(2)与盐水组相比,模型组PGE2升高,针刺组降低,未见统计学差异(P>0.05);与模型组比,针刺组PGE2降低,有统计学差异(P<0.05);提示针刺可下调脊髓致痛因子COX2、PGE2的含量。结论:1.基于针刺双侧足三里改善AIA大鼠炎性痛效应,发现血液升高的CXCL1是针刺上调脊髓CXCL1的重要来源。2.脊髓中CXCL1参与针刺镇痛。3.针刺升高脊髓CXCL1可促使脊髓CXCR2受体脱敏,下游致痛因子COX2、PGE2下降,发挥镇痛作用4.针刺导致脊髓部位CXCL1-CXCR2受体脱敏的机制与GRK6通路无关,其机制尚需进一步探究。