目的:探讨益气解毒活络中药组分配伍对人肾小球系膜细胞损伤的保护作用,阐明益气解毒活络中药组分配伍防治糖尿病肾病的疗效机制,为临床防治糖尿病肾病提供新的思路,同时为将来新药的开发提供理论实验基础。方法:1.细胞来源人肾小球系膜细胞株（HBZY-1）惠赠自辽宁中医药大学基础医学院实验室2.实验药物黄芪甲苷:产品批号201314,辽宁北方药检科技开发有限公司盐酸小檗碱:产品批号15010411,北京盈泽纳新化工技术研究院水蛭素:产品批号V0145,格雷西亚（成都）化学技术有限公司木樨草苷:产品批号15012204,购自北京盈泽纳新化工技术研究院3.细胞培养将人肾小球系膜细胞（GMC）用吸管将细胞悬混液移入100ml培养瓶中复苏后,加入完全培养液（DMEM+10 mL/dL胎牛血清含100 U/mL青、链霉素）。每日在倒置显微镜中观察细胞生长状态,当细胞大部分贴壁时（80%）,用移液管吸出培养液,加入0.25%胰蛋白酶消化3分钟,倒置显微镜下观察细胞逐渐脱落时,加入DMEM（低糖完全培养基）溶液终止消化,用移液管轻轻吹打至悬混液状态,将细胞悬混液移入15mL离心管,1200转/分离心10分钟,去上清后,加入DMEM（低糖完全培养基）调整细胞浓度至1×10⁵/mL,按1:3比例接种于25mL细胞培养瓶中将培养瓶放入5%CO₂、37℃的培养箱中培养,每2d传代1次,约传代4次以后开始进行试验。4.实验分组1.在实验一、二、三中将人肾小球系膜细胞按4因素3水平正交设计方案分为以下11组:正常组（5.6mM葡萄糖）高糖高脂模型组（30mM葡萄糖+20mg/L LPC）1组:盐酸小檗碱（低）黄芪甲苷（低）水蛭素（低）木樨草苷（低）2组:盐酸小檗碱（低）黄芪甲苷（中）水蛭素（中）木樨草苷（中）3组:盐酸小檗碱（低）黄芪甲苷（高）水蛭素（高）木樨草苷（高）4组:盐酸小檗碱（中）黄芪甲苷（低）水蛭素（中）木樨草苷（高）5组:盐酸小檗碱（中）黄芪甲苷（中）水蛭素（高）木樨草苷（低）6组:盐酸小檗碱（中）黄芪甲苷（高）水蛭素（低）木樨草苷（中）7组:盐酸小檗碱（高）黄芪甲苷（低）水蛭素（高）木樨草苷（中）8组:盐酸小檗碱（高）黄芪甲苷（中）水蛭素（低）木樨草苷（高）9组:盐酸小檗碱（高）黄芪甲苷（低）水蛭素（中）木樨草苷（高）盐酸小檗碱低、中、高剂量分别为20μM、60μM、180μM;黄芪甲苷低、中、高剂量分别为20μM、60μM、180μM;水蛭素低、中、高剂量分别为0.5μM、1.5μM、4.5μM;木犀草苷低、中、高剂量分别为60μM、180μM、540μM。2.根据实验一、二、三分析结果,选取益气解毒活络中药最佳配伍方案进行实验四,现分组如下:正常组（5.6mM葡萄糖）高糖高脂模型组（30mM葡萄糖+20mg/L LPC）第一组:盐酸小檗碱（低）黄芪甲苷（低）水蛭素（低）木樨草苷（高）第二组:盐酸小檗碱（低）黄芪甲苷（低）水蛭素（低）木樨草苷（低）第三组:盐酸小檗碱（低）黄芪甲苷（中）水蛭素（中）木樨草苷（中）盐酸小檗碱低、中、高剂量分别为20μM、60μM、180μM;黄芪甲苷低、中、高剂量分别为20μM、60μM、180μM;水蛭素低、中、高剂量分别为0.5μM、1.5μM、4.5μM;木犀草苷低、中、高剂量分别为60μM、180μM、540μM。5.指标检测实验一:MTT法检测各组24h、48h、72h GMC增殖情况。实验二:qRT-PCR法检测各组FN、COLIV 24、48h mRNA表达ELISA法检测各组FN、COLIV、AGEs 48h蛋白活性表达实验三:qRT-PCR法检测各组TGF-β1、MCP-1 24、48h mRNA表达ELISA法检测各组TGF-β1、MCP-1 48h蛋白活性表达实验四:qRT-PCR法检测各组PPAR-γ24、48h mRNA表达WesternBlot法检测各组PPAR-γ24、48h蛋白活性表达WesternBlot法检测高糖高脂模型组0、15、30、60、90、120min NF-κB蛋白表达,选出NF-κB表达最高时间点。WesternBlot法检测各组60、90min NF-κB蛋白表达核转染法检测各组60、90min NF-κB核转染情况6.数据处理采用SPSS17.0统计软件处理实验数据,所有数据以±s表示,各组数据均用正交设计方差分析,各组间均数比较运用LSD法,P<0.05具有统计学意义。结果:1.益气解毒活络中药组分配伍对高糖高脂诱导GMC细胞增殖情况的影响通过MTT法观测各组各时间点GMC增殖情况变化发现:与模型组比较在24、48、72h三个时间点各中药配伍组GMC细胞增殖均显著降低（P<0.01）。与正常对照组比较模型组各时间点GMC细胞增殖显著升高有显著差异（P<0.01）;24h时间点1、2、3组未见明显差异（P>0.05）,其余各组均有显著差异（P<0.01）;48h时间点1、2组未见明显差异（P>0.05）,其余各组均有显著差异（P<0.01）;72h时间点各中药配伍组均未见显著差异（P>0.05）。各中药配伍组组间比较发现:24h时间点7、9组GMC细胞增殖下降最明显（P<0.01）;48h时间点6、7、8组GMC细胞增殖下降明显（P<0.01）;72h时间点除第5、7组组间有统计学差异（P<0.05）,其余各组组间比较均无统计学差异（P<0.01）。24h、48h、72h三个时间点比较正常组48h细胞增殖高于24h及72h（P<0.01）,模型组72h细胞增殖高于24h及48h（P<0.01）到达增殖巅峰,中药组分配伍6、7、8组48h细胞增殖高于24h及72h（P<0.01）。2.益气解毒活络中药组分配伍对高糖高脂诱导GMC细胞FN mRNA表达影响24h:与正常组比较,除1组外,模型组及各中药配伍组FN mRNA变化具有显著差异（P<0.01）;与模型对照组比较,各中药中药组分配伍组FN mRNA相对表达量均有显著下降（P<0.01）;各中药配伍组组间比较发现1、2组下调FN mRNA表达最明显（P<0.01）。48h:与正常组比较,模型组及各中药配伍组FN mRNA变化均有显著差异（P<0.01）;与模型对照组比较,中药配伍组FN mRNA相对表达量均有明显下降（P<0.01）;各中药配伍组组间比较发现1、2组下调FN mRNA表达最明显（P<0.01）。正常组及模型组24、48h两个时间点FN mRNA表达未见显著差异（P>0.05）;中药组分配伍1组与2组48h FN mRNA表达均低于24h FN mRNA表达（P<0.01）。3.益气解毒活络中药组分配伍对高糖高脂诱导GMC 48h FN蛋白活性表达影响与正常对照组比较,模型对照组及中药配伍各组均有明显上升（P<0.01）;与模型组比较,各中药中药组分配伍组比较FN蛋白活性表达均有显著下调;各中药正交组组内比较发现,第1组下调FN蛋白活性表达作用最大（P<0.01）。4.益气解毒活络中药组分配伍对高糖高脂诱导GMC细胞COLIV mRNA表达影响24h:与正常组比较,除去1组,模型组及各中药配伍组COLIV mRNA变化均有显著差异（P<0.01）,与模型组相比较各中药配伍组COLIV mRNA相对表达量均有明显下调（P<0.01）,中药配伍组组间比较发现2组和3组,6组和8组之间无显著差异（P>0.05）,其中1、2组COLIV mRNA下调最明显（P<0.01）。48h:与正常组比较,模型组及各中药配伍组COLIV mRNA变化均有显著差异（P<0.01,第1组P<0.05）,与模型组比较中药配伍组COLIV mRNA相对表达量均有明显下调（P<0.01）,中药配伍组组间比较发现第2、3组组间无统计学差异（P>0.05）,且COLIV mRNA下调最明显（P<0.01）。正常组、模型组及中药组分配伍1组24、48h两个时间点ColIV mRNA表达未见显著差异（P>0.05）;中药组分配伍2组与3组48h FN mRNA表达均低于24h FN mRNA表达（P<0.01）。5.益气解毒活络中药组分配伍对高糖高脂诱导GMC细胞48h COLIV蛋白活性表达的影响与正常组比较,除1组未见明显差异（P>0.05）,模型对照组及中药配伍组均有明显上升（P<0.01）;与模型组比较各中药配伍组比较COlIV蛋白活性表达均有显著下调;各中药配伍组组内比较发现,1组下调COlIV蛋白活性表达作用最大（P<0.01）。6.益气解毒活络中药组分配伍对高糖高脂诱导GMC细胞48h AGEs蛋白活性表达的的影响与正常组比较,除1组外,模型组及各中药配伍组AGEs蛋白活性表达均显著增高（P<0.01）;与模型组比较各中药配伍组AGEs蛋白活性表达均显著下调（P<0.01）;各中药配伍组组间比较发现第1组下调AGEs蛋白活性作用优于其余各中药配伍组（P<0.01）。7.益气解毒活络中药组分配伍对高糖高脂诱导GMC细胞TGF-β1 mRNA表达影响与正常对照组相比较,模型组及各中药配伍组24、48h TGF-β1 mRNA变化均有显著差异（P<0.01）;与模型对照组比较,各中药配伍组24、48h TGF-β1 mRNA相对表达量均有明显下降（P<0.01）;中药配伍组组间比较,2组下调24、48h TGF-β1 mRNA表达最明显（P<0.01）。正常组及模型组24、48h TGF-β1 mRNA表达未见显著差异（P>0.05）;中药组分配伍2组48h TGF-β1 mRNA表达显著低于24h（P<0.01）8.益气解毒活络中药组分配伍对高糖高脂诱导GMC细胞48h TGF-β1蛋白活性表达影响与正常组比较,模型组及中药配伍组TGF-β1蛋白活性表达均有明显上升（P<0.01）;与模型组比较,各中药配伍组TGF-β1蛋白活性表达均有显著下调（P<0.01）;各中药配伍组组内比较发现,2组下调TGF-β1蛋白活性表达作用最佳（P<0.01）。9.益气解毒活络中药组分配伍对高糖高脂诱导GMC细胞MCP-1 mRNA表达影响24h:与正常组比较,除1组（P>0.05）,模型组及其余各中药配伍组均有显著差异（P<0.01）;与模型组比较各中药配伍组MCP-1 mRNA相对表达量均有明显下降（P<0.01）;中药配伍组组间比较发现1组下调MCP-1 mRNA表达最明显（P<0.01）。48h:与正常组相比较,模型组及中药配伍组均有显著差异（P<0.01）,与模型组比较各中药配伍组MCP-1 mRNA相对表达量均有明显下降（P<0.01）,中药配伍组组间比较发现1组MCP-1mRNA下降最明显（P<0.01）。正常组及模型组24、48h MCP-1 mRNA表达未见显著差异（P>0.05）;中药组分配伍1组48h MCP-1 mRNA表达显著低于24h（P<0.05）。10.益气解毒活络中药组分配伍对高糖高脂环境下GMC细胞PPAR-γmRNA表达影响24h:与正常组比较模型组及中药配伍组均有显著差异（P<0.01）;与模型组比较各中药配伍组PPAR-γmRNA表达均明显上升,且有显著差异（P<0.01）;各中药配伍组组间比较发现第一组PPAR-γmRNA表达最高（P<0.01）。48h:与正常组比较除去第一组未见明显差异（P>0.05）,模型组及其余各用药组均有显著差异（P<0.01）;与模型组比较各中药配伍组PPAR-γmRNA表达均明显上升,且有显著差异（P<0.01）;各中药配伍组组间比较发现第一组PPAR-γmRNA表达最高（P<0.01）。正常组24h、48h两时间点PPAR-γmRNA表达未见显著差异（P>0.05）,模型组及第一、二、三组48h PPAR-γmRNA表达显著高于24h PPAR-γmRNA表达（P<0.01）。10.高糖高脂环境对GMC细胞NF-κB蛋白表达的影响通过WesternBlot法对高糖高脂模型组0、15、30、60、90、120min这6个时间点NF-κB蛋白表达检测,发现第90min NF-κB蛋白表达最显著。11.益气解毒活络中药组分配伍对高糖脂环境下GMC细胞NF-κB蛋白表达的影响与正常组比较模型组60min、90min蛋白表达水平显著增高,各中药配伍组比较发下60min时第三组下调NF-κB蛋白表达水平最显著;90min时第一、三组下调NF-κB蛋白表达水平最显著。12.益气解毒活络中药组分配伍对高糖高脂环境下NF-κB核转染变化的影响与正常组比较模型组60min、90min NF-κB亚基p65主要分布在细胞核内,而正常组及各中药配伍组p65大多分布在细胞核外。结论:1.益气解毒活络中药组分配伍能够抑制高糖高脂诱导的人肾小球系膜细胞（GMC）异常增殖,并下调GMC细胞外基质纤维黏连蛋白（FN）、四型胶原蛋白（COLIV）mRNA及蛋白水平表达,下调晚期糖基化终末产物（AGEs）蛋白活性表达水平。提示益气解毒活络中药组分配伍能够通过抑制GMC细胞外基质及AGES合成起到延缓肾小球动脉硬化的作用。2.益气解毒活络中药组分配伍能够抑制GMC细胞TGF-β1、MCP-1、NF-κB表达,上调PPAR-γ表达水平。提示益气解毒活络中药组分配伍能够通过调节相关细胞因子及信号通路的表达起到防治DN的作用。3.益气解毒活络中药组分配伍可能是通过抑制TGF-β/NF-κB信号途径下调MCP-1、FN、COLIV、AGEs的表达及上调PPAR-γ表达水平的作用来保护受损的GMC,从而起到减缓DN病程进展,保护受损肾脏的作用。4.益气解毒活络中药组分配伍最佳配伍方案为盐酸小檗碱（低剂量20μM）黄芪甲苷（低剂量20μM）水蛭素（低剂量0.5μM）木樨草苷（高剂量540μM）。