【摘 要】
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该试验希望能建立高效的苜蓿基因转化系统,并应用转基因植物进行外源蛋白的表达和靶向定位研究.在比较晋南苜蓿(Medicago sativa L.cv.Jinnan)和四倍体苜蓿(Medicago falcata
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该试验希望能建立高效的苜蓿基因转化系统,并应用转基因植物进行外源蛋白的表达和靶向定位研究.在比较晋南苜蓿(Medicago sativa L.cv.Jinnan)和四倍体苜蓿(Medicago falcata L.line 47/1-5)不同外植体再生能力的基础,研究了TDZ和2,4-D对苜蓿体胚发生的调控作用,建立了适合于遗传转化的以体胚切导体为外植体的高效体胚发生和植株再生培养体系.同时探讨了TDZ引起苜蓿愈伤组织胚性丧失及对愈伤组织蛋白合成模式和体胚发生能力影响的作用机制.利用苜蓿体胚作为根癌农杆菌介导转化的受体,通过分析GUS基因的瞬间表达率对转化体系的实验参数进行优化.应用上述优化参数,用含质粒载体pCAMBIA2301(带有CaMV35S启动子调控的GUS基因和nptⅡ基因)的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404对晋南苜蓿(Medicago sativa L.cv.Jinnan)体胚切块进行了3批共158个外植体的转化实验,共获得15株来自12个卡那霉素抗性株系的再生植株,经组织化学染色和分子检测,证实GUS基因已整合到转化植株基因组中,在各种器官和组织中均有表达,并且在土壤栽培过程中保持稳定.为了利用上述转化体系获得转基因植物研究外源蛋白在苜蓿细胞中的表达和定位过程,已成功地通过根癌农杆菌LBA4404/pSYFP491K介导将信号肽-黄色荧光蛋白-靶向定位蛋白序列融合基因(SYFP491)导入四倍体苜蓿(Medicago falcata L.line 47/1-5).经过50mg/L卡那霉素筛选得到抗性愈伤组织,PCR扩增和Southern杂交检测证实外源基因已整合到愈伤组织基因组中.荧光检测可见转基因愈伤组织黄色荧光表达,经放大观察黄色荧光来自细胞内局部区域.
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