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研究分为两个部分:一、HBV cccDNA定量检测方法的建立;二、乙肝病毒在慢性HBV感染者疾病不同阶段复制特点。一、HBV cccDNA定量检测方法的建立目的:建立一种特异性、敏感性高的乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA（HBVcccDNA）的定量检测方法。方法:构建含HBV目的序列的重组质粒,利用HBV cccDNA的选择性引物/探针（简称71F）以及总HBV DNA引物/探针（简称13F）建立实时荧光定量PCR反应,分析其灵敏度、重复性和线性范围。进一步利用重组质粒、血清和肝组织DNA等不同模板优选最佳PCR扩增体系,其中依据模板的不同处理方法分为无酶切组、限制性内切酶酶切组、PSAD酶切组、限制性内切酶联合PSAD酶切组,比较各组对HBV cccDNA检测的特异性。结果:通过对已有特异性检测方法进行优化,并针对特异性引物扩增效率和PSAD酶切等环节进行详细探讨,所建立的荧光定量检测体系,HBV cccDNA特异性引物/探针及总HBV DNA引物/探针检测灵敏度均达到102拷贝/ml,两对引物探针检测线性范围均为4×102-4×1011拷贝/mL。荧光定量检测体系重复性批内差:13F与71F CV均<3%;批间差:13F CV<4%,71F CV<3%。对质粒和临床样本定量检测结果证实13F、71F与商业试剂盒之间具有相同的扩增效率,在保证定量结果仅与样本DNA含量相关前提下,根据各组间比较,显示血清应用PSAD酶切再应用特异性引物探针扩增的方法定量检测HBV cccDNA结果最为特异,可降低4个log值的非特异扩增;肝组织应用MluI与PSAD联合酶切,再应用特异性引物探针扩增的方法定量检测HBV cccDNA结果最为特异,可降低5个log值的非特异扩增。结论:建立一种新的样本处理方法,可以进一步提高HBV cccDNA检测特异性,构建一种特异性、灵敏性较好的HBV cccDNA定量检测方法。二、乙肝病毒在慢性HBV感染者疾病不同阶段复制特点目的:研究慢性乙型肝炎（CHB）、乙肝肝硬变（LC）、乙肝相关性原发性肝癌（HCC）患者血清和肝组织中总HBV DNA、HBV共价闭合环状DNA（HBVcccDNA）分布及其与其它临床指标关系,分析疾病不同阶段状态病毒复制特点及其与疾病进展的关系。方法:应用荧光定量PCR方法对21例慢性乙型肝炎、23例乙肝肝硬变、25例乙肝相关性原发性肝癌患者血清和肝组织样本总HBV DNA及HBV cccDNA进行定量检测。结果:血清总HBV DNA、肝组织总HBV DNA、肝组织HBV cccDNA以及肝组织HBV cccDNA占总HBV DNA比例在慢性乙型肝炎、乙肝肝硬变、乙肝相关性原发性肝癌患者中呈降低趋势,其中慢性乙型肝炎与原发性肝癌患者血清总HBV DNA、肝组织总HBV DNA差异存在统计学意义（P值均小于0.05）;慢性乙型肝炎、乙肝肝硬变患者肝组织HBV cccDNA及肝组织HBV cccDNA占总HBVDNA比例明显高于原发性肝癌患者（P值均小于0.01）;血清HBV cccDNA在慢性乙型肝炎、乙肝肝硬变、乙肝相关性原发性肝癌患者中检测均阴性。慢性乙型肝炎HBeAg（+）组血清总HBV DNA、肝组织总HBV DNA、肝组织HBV cccDNA均明显高于HBeAg（-）组（p值均小于0.01）;乙肝肝硬变HBeAg（+）组肝组织总HBVDNA及肝组织HBV cccDNA明显高于HBeAg（-）组（P值均小于0.05）,血清总HBVDNA前者虽高于后者但无统计学差异;乙肝相关性原发性肝癌患者血清总HBVDNA、肝组织总HBV DNA、肝组织HBV cccDNA虽HBeAg（+）组高于HBeAg（-）组,但均无统计学差异。血清总HBV DNA、肝组织总HBV DNA、肝组织HBVcccDNA三者间相关性在慢性乙型肝炎、乙肝肝硬变、乙肝相关性原发性肝癌呈减弱趋势,而血清总HBV DNA、肝组织总HBV DNA、肝组织HBV cccDNA与ALT、TBIL在上述疾病三个阶段均无相关性。结论:慢性乙型肝炎、乙肝肝硬变、原发性肝癌患者体内病毒复制活性逐渐减低,但乙肝肝硬变与慢性乙型肝炎患者病毒复制无统计学差别。HBeAg（+）组患者在疾病不同阶段病毒复制活性均较HBeAg（-）组高。