论文部分内容阅读
目的：间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是不同于造血基质细胞的干细胞群，具有多分化潜能，是骨髓基质、骨、软骨、肌肉、腱、脂肪和结缔组织细胞的前体细胞。已有报道，MSCs存在于骨髓、外周血、脐血等。已证实骨髓间质细胞具有在特定条件下分化为成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞的能力。Oscar等将人脐血来源的MSCs诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞。与之相比，Mareschi等通过细胞化学和分子生物学法证明骨髓MSCs分化成成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，而脐血细胞不能分化且很快死亡。因此，脐血来源MSCs有无此分化能力存在争议。已有研究神经移植可促进缺血大脑的再生，胎儿神经干细胞能减轻脑损伤的动物和人的行为缺陷，但胚胎移植受伦理限制。MSCs已用于严重成骨不全和癌症患者的细胞治疗和基因治疗，对于治疗其它疾病的研究也相继展开。MSCs植入正常大鼠脑后能分泌神经因子，成为神经胶质。另外，骨髓细胞静脉注射给大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠，可穿过血脑屏障到达缺血部位并分化成少量星型胶质细胞。全骨髓细胞和体外培养的MSCs脑内移植入MCAO 1天的大鼠和小鼠，可表达神经细胞表型并促经功能恢复。但骨髓干细胞的分化增殖能力会随年龄增加而降低，因此有必要寻找其它来源的干细胞。关于脐血MSCs在中枢神经系统的存活生长的研究很少。因此本研究拟探索大鼠胎血MSCs的分离扩增，诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞的培养条件；MSCs经尾静脉移植入MCAO的大鼠后观察其神经功能恢复及植入细胞的存活、迁移和向神经细胞分化的情况，为脐血干细胞治疗人类缺血性神经系统疾病提供实验依据。
方法：1．MSCs的体外培养无菌条件下，取孕20天大鼠的胎血至含肝素30U/ml的低糖DMEM培养液中。密度梯度离心法收获单个核细胞(monorluclear cells，MNCs)，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered
saline，PBS)洗涤后接种于含10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml的低糖DMEM培养液传代培养。1周后弃掉未贴壁细胞，以后每周换液2次。扩增MSCs的鉴定：α-丁酸萘酚酯酶(α-naphthol butyric acid esterase，NBE)、硷性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)两种细胞化学染色；流式细胞仪检测MSCs免疫表型CD44、CD54、CDIIb、CD45的表达情况。 2．MSCs的诱导分化及鉴定
(1)向成骨细胞分化第5代MSCs，种植于含有0.1 μmol/L地塞米松、10mmol/Lβ一甘油磷酸和0.2mmol/L抗坏血酸的DMEM培养液。细胞化学染色茜素红、碱性磷酸酶检测。
(2)向脂肪细胞分化第5代MSCs，种植于含1 μmol/L氢化考的松、0.5mmol/L异丁基甲基黄嘌呤(3-isobutyl—l—methylxanthine，IBMX)、0.1mmol/L消炎痛和10％兔血清的DMEM培养液。油红O染色检测脂肪细胞的形成。
(3)向神经细胞分化 以β-巯基乙醇(β—mercaptoethanol，β—ME)、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)、叔丁基对羟基茴香醚(butylatedhydroxyanisole，BHA)定向诱导扩增第5代的MSCs向神经元样细胞分化，免疫细胞化学法鉴定神经细胞标志物巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(neuron—specific enolase，NSE)、神经胶原纤维酸性蛋白(glialfibrillary acidic protein，GFAP)的表达。
3．MCAO模型的建立和细胞移植 5溴-2脱氧尿核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)标记备用的MSCs，移植前流式细胞仪检测BrdU标记率、台盼蓝排斥实验检测MSCs活性。30只雄性成年大鼠MCAO模型分组：移植组通过尾静脉每只大鼠注射含6×10<6>个MSCs的生理盐水1ml；生理盐水组注射等量生理盐水；手术组不作任何处理。手术后1、7、14、21、28天采用改良神经功能损害评分(modified neurological severity score，mNSS)对大鼠进行行为学检查；组织学检测肝、肾、脾有无免疫排斥反应；免疫组织化学双染技术检测脑组织切片中BrdU标记的MSCs的存活、迁移及其Nestin、GFAP和NSE的表达。
结果：1．MSCs体外培养及鉴定 大鼠胎血中存在MSCs且可大量扩增，呈成纤维细胞样生长。细胞化学染色示其NBE阳性，ALP阴性，流式细胞仪检测显示MSCs表达CD44、CD54，不表达CD11b、CD45。
2．诱导分化及鉴定
(1)向成骨细胞分化原来梭形MSCs逐渐变宽、平，诱导2周后，茜素红染色证实细胞内有钙沉积，碱性磷酸酶染色阳性。
(2)向脂肪细胞分化诱导1周后，MSCs可见有脂滴形成，油红染色阳性。
(3)向神经细胞分化诱导后MSCs形态学观察类似于神经元，免疫细胞化学检测发现其Nestin和NSE阳性，GFAP阴性。
3．MCAO模型的建立和细胞移植 MSCs移植前，流式细胞仪检测BrdtJ标记率为93％，台盼蓝排斥实验检测MSCs活细胞率是97.8％。MCAOl4天以后，MSCs移植组大鼠比对照组的神经功能恢复显著(P<0.05)。肝、肾、脾组织结构无异常、无免疫排斥反应。移植的MSCs细胞可在大鼠脑组织中存活，并向缺血区域迁移，BrdU阳性细胞中(2.88±0.76)％表达Nestin，(5.24±1.06)％表达GFAP，(1.34±1.29)％表达NSE。
结论：大鼠胎血能够分离、扩增培养出丰富MSCs，在适当条件下可向成骨细胞、脂肪细胞、神经元样细胞定向诱导分化。体外扩增纯化后的MSCs可促进局灶性脑缺血大鼠的神经功能恢复，移植细胞可在大鼠脑缺血区域中存活、迁移并向神经干细胞、星形胶质细胞和神经元分化。胎血MSCs具有扩增能力强、方便易得、无免疫排斥等特点，进行移植治疗局灶性脑缺血，已显示其可行性且疗效明显，这些为人脐血MSCs治疗脑缺血提供了实验依据。