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番鸭的就巢一直是困扰养殖行业的重要问题,虽然已有学者对番鸭的就巢性进行过研究报道,但更多局限于某一基因对特定发育阶段和部位所起的作用。为了探究ERK信号通路相关基因在番鸭就巢调控中的作用,本试验利用SMART-RACE技术和生物信息学方法研究了细胞外信号调节激酶2(ERK2)和生长因子受体结合蛋白2(GRB2)的基因特征;同时采用qRT-PCR技术对番鸭不同组织不同时期ERK信号通路中的相关基因进行了表达谱分析;并结合Cytoscape软件构建了这些基因在不同时期下的相互作用网络调控模式图。结果如下:1.番鸭ERK2的cDNA序列全长3037bp,包括5’非编码区194bp、3’非编码区1736bp和ORF区1107bp,其中ORF区能够编码368个氨基酸。预测其相对分子质量为41.9kDa,等电点6.36;二级结构编码的蛋白含35.05%的α螺旋、8.97%的β折叠和55.98%的无规则卷曲,属于一种亲水性稳定蛋白,不存在信号肽和跨膜结构。同源比对发现该基因与绿头鸭、鸿雁的mRNA同源性较高,进化分析表明其与绿头鸭的亲缘关系最近。qRT-PCR结果显示,ERK2基因在番鸭卵巢、下丘脑中的表达量极显著高于其他各组织器官(P<0.01)。在不同时期(青年期、产蛋期、就巢期)的性腺轴中,ERK2基因都是在卵巢上表达量最高,且差异极显著(P<0.01);在下丘脑和垂体上的差异性规律与卵巢相似,产蛋期高于青年期和就巢期,差异显著(P<0.05)。2.番鸭GRB2基因全长3528bp,它包括5’非编码区47bp,3’非编码区2827bp和ORF区654bp,其中ORF区可以编码217个氨基酸。预测其相对分子质量为25.2 kDa,等电点5.78;蛋白结构预测显示,GRB2蛋白包含SH3-SH2-SH3三个功能域,是一种亲水性稳定蛋白,不存在信号肽和跨膜结构;同源比对发现该基因与绿头鸭的mRNA的同源性较高,进化分析表明其与吐绶鸡的亲缘关系最近。qRT-PCR结果表明,GRB2基因在卵巢中的表达量极显著高于其他组织(P<0.01);在产蛋期卵巢上表达量最高,三个不同的生长时期之间差异显著(P<0.05);在下丘脑上的表达量从青年期到就巢期先升高后降低;而在垂体上的表达量从青年期到就巢期一直递减,差异显著(P<0.05)。3.从转录组EST数据库中筛选获得了其它20个ERK信号通路相关基因,检测到这些基因在不同时期番鸭的卵巢中,都有不同程度上的变化。结果表明,Mek2、Rap16、MRAS、Elk1、PLCB1、SRF、Raf1、Mos、Pak1、Crebl2、SOS1、SOS2、RASA2、ERK2、GRB2 等15个基因在番鸭23周龄、36周龄、50周龄的卵巢组织中表达存在显著差异(p<0.05),DUSP4、MAP2K1、MYC、PRKACB、GPR39、RPS6KA3、Mknk1等7个基因在番鸭不同时期的卵巢中稳定表达。其中GRB2、ERK2、SRF、SOS1、PLCB1、RASA2在产蛋期卵巢中的表达量高于青年期和就巢期。利用Cluster软件对这些基因在不同时期的表达情况进行了分层聚类分析,结果表明同一基因在不同时期的卵巢中有着不同程度的差异性,不同基因在同一时期也启动了不同的基因表达模式。4.以产蛋期基因的表达为参照,用Cytoscape软件构建青年期和就巢期番鸭卵巢的网络调控模式图。结果显示,Elk1基因在青年期中出现了明显的上调,MYC、RASA2、SOS1、SOS2、MRAS、PLCB1基因出现了明显的下调,提示这些基因可能在番鸭卵巢生长发育过程中具有重要作用;Rap16、MRAS、Mek2、Raf1和Mos基因在就巢期中出现了明显的上调,GRB2、ERK2和SRF基因出现了明显下调,表明这些基因可能在番鸭就巢过程中发挥着调控作用。以上两个时期的网络调控模式图在一定程度上揭示了 ERK信号通路相关基因对番鸭卵巢发育和就巢产生的不同影响。