【摘 要】
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自2019年1月在我国武汉首次报道由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的新冠肺炎（COVID-19）病例以来,该病在世界各地迅速传播,据世界卫生组织（WHO）统计,截止到2022年2月4日,已报道全世界有440,807,756例确诊病例,死亡5,978,096人,造成了巨大的人员财产损失和严重的公共卫生灾难,引起了国内外广泛关注。鉴于当前全球性新冠肺炎大流行的严峻局面,同时针对国内外人员往来
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自2019年1月在我国武汉首次报道由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的新冠肺炎（COVID-19）病例以来,该病在世界各地迅速传播,据世界卫生组织（WHO）统计,截止到2022年2月4日,已报道全世界有440,807,756例确诊病例,死亡5,978,096人,造成了巨大的人员财产损失和严重的公共卫生灾难,引起了国内外广泛关注。鉴于当前全球性新冠肺炎大流行的严峻局面,同时针对国内外人员往来、货物运输密切导致的新冠肺炎迅速传播的现状,迫切需要研发一种快速、准确、灵敏度高、特异性强和操作简单的检测技术,特别是能够满足快速即时检验（POCT）,即能够检测活病毒的存在,这对于及时防控由人员往来和物流导致的病毒传播等都具有十分重要的意义,而目前尚未见具有综合了以上特点的新冠病毒快速检测技术及其试剂盒的报道及其应用。本研究利用新型冠状病毒棘突蛋白（Spike protein,S蛋白）在人体内识别的靶点-血管紧张素转化酶2蛋白受体（human angiotensin-converting enzyme 2,hACE2）的特性,设计了两种针对新冠病毒活病毒S蛋白的检测方法,主要工作内容如下:1.利用双分子荧光互补技术结合特异性识别新冠病毒S蛋白多肽技术利用红色荧光蛋白（mCherry）的双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation,BiFC）效应以及SARS-CoV-2病毒S蛋白与hACE2受体特异性识别的原理,将mCherry红色荧光蛋白在其氨基酸残基的159-160处分成二个片段,并将两段分别连接识别SARS-CoV-2病毒S蛋白的多肽,通过一系列分子实验合成了两个荧光蛋白的DNA序列,分别构建了mCherry蛋白的N和C端两个表达载体,并通过原核表达、标签纯化等手段获得了两个蛋白探针。通过镍柱（NiNTA）分离纯化两个荧光蛋白。在反应体系中加入新冠病毒S蛋白,两个多肽识别并同时结合到新冠病毒S蛋白,形成三蛋白复合体而产生BiFC效应,确认了两个荧光蛋白可以正常触发BiFC反应。测量了荧光蛋白与S蛋白互作产生BiFC效应的荧光强度。2.利用聚集诱导发光结合识别多肽特异性检测新冠病毒S蛋白利用SARS-CoV-2病毒S蛋白与hACE2受体特异性结合的原理,开发了一种利用四苯基乙烯荧光素（TPE）荧光素聚集诱导发光（Aggregation-Induced Emission,AIE）效应的特异性检测SARS-CoV-2病毒S蛋白的荧光探针。该探针包括识别SARS-CoV-2病毒S蛋白的多肽和TPE荧光基团二种成分,其中识别多肽是根据hACE2受体特异性识别、结合S蛋白的结构域而设计,通过化学合成将TPE与识别多肽连接成荧光多肽探针,通过S蛋白与荧光多肽探针结合后的AIE效应（产生激发荧光）而达到快速检测SARS-CoV-2病毒的目的。经试验验证,荧光多肽探针可检测低至10 f M的S蛋白三体,证明了我们的检测方法方法对S蛋白有较高的灵敏性,并且反应稳定,荧光长时间不会消散。通过正常人咽拭子与荧光多肽探针在室温下进行互做实验,证明了本检测方法不受正常人体口腔中的蛋白与唾液的影响。将探针分别与表达不同浓度的SARSCoV-2病毒表面S蛋白的慢病毒（假病毒）在室温下互作实验,表明在短时间内荧光多肽探针即可与不同浓度的慢病毒产生相互作用,并可以激发探针的AIE效应,在465纳米处产生强烈的发射峰,并且探针的AIE效应强弱与慢病毒的浓度呈正比。与以上与S蛋白实验相互印证。证明这种检测方法对假病毒同样具有较高的检测灵敏度,具有良好的推广应用前景。
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