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目的:研究非小细胞肺癌(Non-small-cellcarcinoma NSCLC)的进展中Fibulin-5的作用以及其可能的调控机制及相关信号通路。方法:1.利用Heatmap分析肺癌基因图库(The Cancer Genome Atlas TCGA),并将肺癌RNA序列及DNA甲基化数据与正常肺组织比对,并分析肺癌中Fibulin-5及MMP-7(金属蛋白酶-7)以及c-myc的表达趋势。2.构建Fibulin-5表达工具质粒,利用转染技术转染入A549,H1299及H460细胞系中,利用集落形成试验分析Fibulin-5的作用。3.构建稳定转染Fibulin-5的A549及H1299细胞系,利用MTT生长曲线分析方法分析Fibulin-5的作用。4.利用WB方法分析A549及H1299非小细胞肺癌细胞系细胞核中Fibulin-5与β-catenin表达水平。5.SW480和H1752细胞系中,分别过表达或敲除Fibulin-5后采用间接免疫荧光的方法分析细胞系中Fibulin-5与β-catenin的表达。6.利用免疫组化分析对99例非小细胞肺癌(NSCLC)标本进行Fibulin-5及β-catenin表达相关分析。7.构建β-catenin与MMP-7突变株,利用荧光素酶报告基因分析系统对转染入Fibulin-5的A549及H1299细胞系进行TCF-4位点活性的分析。8.利用WB方法及RT-PCR方法对转染入Fibulin-5的A549,H1299和H1752细胞系进行β-catenin,P-GSK-3β,MMP-7,c-myc及Cyclin-D1表达水平趋势的分析。9.构建β-catenin sh RNA并转染入A549以及H1299细胞系,利用WB及细胞侵袭实验方法分析β-catenin,P-GSK-3β,MMP-7,c-myc及Cyclin-D1表达水平趋势。10.构建GSK-3β敲除sh RNA并转染入稳定表达Fibulin-5的A549细胞系,利用WB及细胞侵袭实验方法分析β-catenin,P-GSK-3β,MMP-7,c-myc及Cyclin-D1表达水平趋势。11.构建RGD序列缺失的Fibulin-5基因并转染入A549,H1299细胞系,利用荧光素酶报告基因分析以及WB方法对RGD序列功能进行分析。12.利用免疫共沉淀方法对Fibulin-5与整合素αvβ3的结合进行分析。13.利用WB方法分析过表达Fibulin-5的A549及H1299细胞系中Fibulin-5与整合素相关通路相关蛋白表达水平的关系。14.使用ERK抑制化合物PD98059对肺癌细胞系A549及H129中ERK的表达进行抑制,通过WB分析ERK的表达和抑制与P-GSK-3β及c-myc的关系。15.将30只BALB/c裸鼠随机分为6组*5只,通过尾静脉注射1×106个H1299细胞和稳定表达Fibulin-5的H1299细胞,0.2ml/只。接种7周后将裸鼠处死,取肺组织测量结节直径并进行相关染色切片。结果:1.通过与数据库中正常肺组织相比,肺癌细胞中Fibulin-5的表达水平明显降低,其中Fibulin-5外显子表达明显下降,而DNA启动子甲基化水平明显增高。在非小细胞肺癌中,Fibulin-5水平与MMP-7及c-myc的表达水平呈显著负相关。2.在相关非小细胞肺癌细胞系中,与转染入对照质粒的对照组相比,过表达Fibulin-5的实验组的集落形成能力显著下降。3.在A549,H1299及H460细胞系中,与转染入空载质粒的对照组相比,稳定表达Fibulin-5的实验组的生长速度显著降低。4.在A549、H1299以及H460等NSCLC中,Fibulin-5与β-catenin蛋白水平呈明显负相关。5.在SW480细胞系(核β-catenin高表达)中过表达Fibulin-5后,间接免疫荧光显示与对照组相比,细胞核中β-catenin蛋白水平明显降低;在H1752细胞系(Fibulin-5高表达)中敲除Fibulin-5后,间接免疫荧光显示与对照组相比,细胞核中β-catenin表达水平显著上升。6.通过对非小细胞肺癌标本进行免疫组化分析表明,肺癌组织中Fibulin-5与β-catenin的表达呈明显负相关。7.荧光素酶报告基因分析显示,在A549及H1299细胞系中过表达Fibulin-5后TCF-4位点活性受到明显抑制;构建β-catenin突变株(突变掉前45个氨基酸,使蛋白无法被降解)转染入细胞后Fibulin-5仍然具有抑制TCF-4位点活性的作用;构建MMP-7突变株(突变TCF-4结合位点使之失效)转染入细胞后Fibulin-5对TCF-4位点活性不再有抑制作用。8.在A549及H1299细胞系中,过表达Fibulin-5使β-catenin,P-GSK-3β,c-myc及cyclin-D1蛋白表达水平下降;在H1752细胞系中,敲除Fibulin-5使β-catenin,P-GSK-3β,c-myc及cyclin-D1蛋白表达水平上调。9.在A549及H1299细胞系中,敲除β-catenin使c-myc及cyclin-D1表达水平显著下调,P-GSK-3β蛋白表达无显著变化。细胞侵袭实验表明敲除β-catenin使细胞侵袭能力降低。10.稳定转染Fibulin-5的A549细胞系中,敲除GSK-3β使β-catenin,c-myc及cyclin-D1水平上调;细胞侵袭实验表明敲除GSK-3β使细胞侵袭能力增强。11.在A549,H1299细胞系中,与过表达野生型Fibulin-5相比,过表达RGD序列缺失的Fibulin-5细胞系无法抑制TCF-4位点活性;WB分析表示,RGD序列缺失的Fibulin-5对β-catenin,P-GSK-3β,c-myc及cyclin-D1蛋白表达水平无作用。12.免疫共沉淀实验表示Fibulin-5可以与细胞表面整合素αvβ3亚基结合13.在A549,H1299细胞系中,过表达Fibulin-5可以使整合素下游p-ERK蛋白表达水平下降。14.在A549,H1299细胞系中,使用PD98059抑制ERK后,P-GSK-3β及c-myc蛋白表达水平明显降低。15.7周后,接种H1299细胞的裸鼠肺转移结节明显大于接种Fibulin-5-H1299细胞的裸鼠,接种H1299细胞的裸鼠的体重也明显低于接种Fibulin-5-H1299细胞的裸鼠。结论:Fibulin-5在大多数NSCLC中由于基因启动子过甲基化而导致沉默,Fibulin-5本身具有抑制肿瘤恶性扩散的作用,究其机制可能是通过调控细胞WNT/β-catenin信号传导通路来抑制下游相关肿瘤蛋白的表达而抑制其转移扩散。