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研究目的流行病学调查和动物实验均已证实高脂膳食诱导肥胖会降低海马内神经可塑性相关蛋白BDNF和突触素(SYN)的表达,并损害海马依赖的学习记忆能力,但其潜在的神经生物学机制还未完全阐明。近几年研究发现,高脂膳食造成的能量过剩会诱发多种外周组织器官的内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS),破坏内质网的蛋白质翻译后修饰、加工、合成等功能,而且ERS能影响细胞内多条信号通路以调控细胞核内的基因转录,在这两方面的作用下会影响成熟蛋白质的生物合成。但高脂膳食诱导SD大鼠肥胖后是否会引发其海马ERS,海马ERS能否调控神经可塑性蛋白表达,这些问题均未见相关的研究报道。本研究通过建立高脂膳食诱导SD大鼠肥胖模型和有氧运动干预(在体实验),并结合高糖脂干预原代培养的海马细胞(离体实验),对肥胖大鼠海马ERS发生的可能机制、ERS调控BDNF和SYN生物合成的相关机制、有氧运动调节海马ERS的可能机制等三方面的内容展开系统研究,探究肥胖影响海马内BDNF和SYN表达的神经生物学机制。研究方法研究一:7周龄雄性SD大鼠150只,普通饲料适应性喂养1周后,根据体重随机分为两组:(1)普通饲料组(normal chow diet,NCD组,n=40),大鼠给予普通饲料喂养;(2)高脂饲料组(high fat diet,HFD组,n=110),大鼠给予高脂饲料喂养。喂养8周后,以高脂饲料组大鼠体重大于等于普通饲料组大鼠平均体重加1.4倍标准差为标准来筛选高脂膳食诱导肥胖大鼠。肥胖建模后,根据体重随机挑选NCD大鼠和肥胖大鼠并分为四组:普通饲料安静对照组(normal diet control sedentary group,CS组,n=12)、普通饲料运动组(normal diet with aerobic exercise group,CE组,n=12),肥胖安静组(obesity sedentary group,OS组,n=12),肥胖运动组(obesity with aerobic exercise group,OE组,n=12),各组大鼠维持其原有的膳食方式至实验结束。运动组大鼠进行8周的中等强度有氧跑台运动干预后,使用双能X线检测各组大鼠的脂肪重量和脂肪/体重比率。大鼠经麻醉处死后,采集血液,并剥离出大脑两侧的海马,用蛋白抽提试剂盒抽提海马的膜蛋白、胞质蛋白和核蛋白。使用分光光度计检测大鼠血清中的血糖(Blood Glucose,BG)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、总胆固醇(Total Cholesterol,TC)、低密度脂蛋白胆固醇(Low Density Lipoprotein Cholesterol,LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(High Density Lipoprotein Cholesterol,HDL-C)的含量,使用Western Blot检测大鼠海马内如下蛋白的表达水平:转运蛋白GLUT3和FATP1,ERS发生标志蛋白GRP78、p-PERK/PERK、p-IRE1α/IRE1α和p-e IF2α/e IF2α,ERS介导凋亡发生的标志蛋白caspase-12、CHOP,反应抗凋亡能力的蛋白Bcl-2/Bax,神经可塑性蛋白BDNF和SYN,p38/ERK-CREB信号通路活化标志蛋白p-p38/p38、p-ERK/ERK、p-CREB/CREB,NLRP3-IL-1β信号通路活化标志蛋白NLRP3、IL-1β,Nrf2-HO-1信号通路活化标志蛋白Nrf2、HO-1。研究二:SPF级新生SD大鼠(出生2 d以内),雌雄不限,分离出大脑海马细胞并培养至成熟。配制高糖脂培养基、添加ERS抑制剂4-PBA的高糖脂培养基和添加Nrf2激动剂TBHQ的高糖脂培养基,用不同的培养基干预成熟的海马细胞,通过观察细胞的生长状态和流式细胞仪检测细胞存活率,确定不同培养基的最佳使用浓度和干预时间。之后实验分为四组:(1)基础培养基组(对照组),(2)高糖脂培养基组(基础培养基中添加终浓度为50 m M葡萄糖和500μM棕榈酸),(3)ERS抑制剂组(高糖脂培养基中添加终浓度为20 m M抑制剂4-PBA),(4)激动剂组(高糖脂培养基中添加终浓度为100μM的Nrf2的激动剂TBHQ),用不同的培养基干预海马细胞6 h。用RT-PCR法检测海马细胞内BDNF m RNA、SYN m RNA、NLRP3 m RNA、HO-1 m RNA的表达情况,用Western Blot检测海马细胞内研究一中相关蛋白的表达情况。研究结果研究一:1.高脂饲料组大鼠经8周高脂膳食后,其体重显著高于普通饲料组大鼠(p<0.01),符合肥胖标准的大鼠有63只,肥胖建模成功率为57.27%(63/110)。与普通饲料组大鼠相比,肥胖大鼠血清中BG、TG、TC和LDL-C的浓度显著升高(p<0.01),HDL-C浓度显著降低(p<0.01)。2.经8周有氧运动干预后,OE组大鼠的摄食量、能量摄入、体重、全身脂肪重量和脂肪/体重比率均显著低于OS组大鼠(p<0.05,p<0.01),血清中的血糖和TG、TC和LDL-C的浓度浓度也显著降低(p<0.01),HDL-C浓度显著升高(p<0.01)。3.OS组大鼠海马内GLUT3和FATP1蛋白表达水平显著高于CS组大鼠(p<0.01),而OE组大鼠海马内这两种转运蛋白的表达水平显著低于OS组大鼠(p<0.01)。与CS组大鼠相比,CE组大鼠海马内GLUT3表达水平显著升高(p<0.01),但FATP1表达水平没有发生显著性变化。4.与CS组大鼠相比,OS组大鼠海马内ERS发生的标志蛋白GRP78、p-PERK、p-IRE1α和p-e IF2α的含量显著升高(p<0.01),ERS介导凋亡的caspase-12、CHOP及Bax的含量显著升高(p<0.01),Bcl-2的含量显著降低(p<0.01)。与OS组大鼠相比,OE组大鼠海马内ERS发生的标志蛋和ERS介导凋亡发生的标志蛋白的表达水平均显著降低(p<0.01)。5.OS组大鼠海马内pro BDNF、BDNF和SYN的表达水平显著低于CS组大鼠(p<0.01),CE组大鼠海马内这些神经可塑性蛋白的表达水平显著高于OS组大鼠(p<0.01)。与CS组大鼠相比,CE组大鼠海马内这些神经可塑性蛋白的表达水平也显著性升高(p<0.05)。6.与CS组大鼠相比,OS组大鼠海马内p38、ERK和CREB的磷酸化水平显著降低(p<0.01),NLRP3和IL-1β的含量显著升高(p<0.01)。与OS组大鼠相比,OE组大鼠海马内p38、ERK和CREB的磷酸化水平显著升高(p<0.01),而上述两种炎症蛋白的含量显著下降(p<0.01)。与CS组大鼠相比,CE组大鼠海马内上述三种蛋白的磷酸化水平也显著性升高(p<0.05),上述两种炎症蛋白的含量也显著性下降(p<0.05)。7.OS组大鼠海马内Nrf2和HO-1的表达水平显著低于CS组大鼠(p<0.01),而OE组大鼠海马内这两种蛋白的表达水平显著升高(p<0.01)。与CS组大鼠相比,CE组大鼠海马内这两种蛋白的表达水平也显著升高(p<0.01)。研究二:1.由50 m M葡萄糖和500μM棕榈酸配成的高糖脂培养基干预海马细胞后,GLUT3和FATP1的蛋白表达水平显著高于基础培养基组(p<0.01),高糖脂培养基中使用ERS抑制剂或Nrf2的激动剂后与高糖脂培养基组相比,这两种糖脂转运蛋白的表达水平并未发生显著性变化。2.与基础培养基组相比,高糖脂培养基组海马细胞内GRP78、p-PERK、p-IRE1α和p-e IF2α的表达水平显著升高(p<0.01),caspase-12、CHOP和Bax等促凋亡蛋白的含量显著升高(p<0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2的含量显著降低(p<0.01)。使用ERS抑制剂或Nrf2的激动剂后,与高糖脂培养基组相比,除激动剂组海马细胞内Bax表达水平未发生显著性变化外,ERS及其介导的凋亡的发生程度均显著降低(p<0.01),抑制剂组和激动剂组海马细胞Bcl-2的含量均显著增加(p<0.01)。3.与基础培养基组相比,高糖脂培养基组海马细胞内pro BDNF、BDNF和SYN的表达水平均显著降低(p<0.01)。高糖脂培养基中添加ERS抑制剂或Nrf2的激动剂后,这三种蛋白的含量均显著增加(p<0.01)。4.高糖脂培养基组海马细胞内p38、ERK和CREB的磷酸化水平显著低于基础培养基组(p<0.01),BDNF和SYN的m RNA表达水平也显著降低(p<0.01)。高糖脂培养基中添加ERS抑制剂或Nrf2的激动剂后,这三种蛋白的磷酸化水平和BDNF、SYN的基因表达水平均显著上升(p<0.01)。5.与基础培养基组相比,高糖脂培养基组海马细胞内NLRP3炎症小体和IL-1β的蛋白含量显著增加(p<0.05,p<0.01),NLRP3 m RNA表达水平也显著增加(p<0.01)。使用ERS抑制剂或Nrf2的激动剂后,与高糖脂培养基组相比,这两种炎性蛋白的表达水平及NLRP3 m RNA的表达水平均显著降低(p<0.01)。6.高糖脂培养基组海马细胞内Nrf2和HO-1的蛋白含量及HO-1 m RNA表达水平均显著低于基础培养基组(p<0.01),使用ERS抑制剂后,这两种蛋白的含量及HO-1 m RNA的表达水平均未发生显著性变化;但使用Nrf2的激动剂后,这两种蛋白的含量及HO-1 m RNA的表达水平均显著增加(p<0.01)。结论:1.8周的高脂膳食能诱导SD大鼠肥胖,使其出现糖脂代谢紊乱的症状,高糖脂能促进海马内GLUT3和FATP1的蛋白表达。2.高脂膳食诱导肥胖后产生的高血糖、高血脂等能诱发大鼠海马ERS,这不仅能破坏内质网的蛋白合成功能,而且海马ERS还能负向调控p38/ERK-CREB信号通路,正向调控NLRP3-IL-1β信号通路,并引起细胞凋亡,由此降低BDNF和SYN的生物合成。3.8周的有氧运动干预能改善肥胖大鼠糖脂代谢紊乱,降低海马内GLUT3和FATP1的蛋白表达,并能激活海马内Nrf2-HO-1信号转导通路,由此降低海马ERS及其介导凋亡的发生程度,进而增加BDNF和SYN的生物合成。