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猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是养猪业中最为常见的腹泻病,其病原体为α-冠状病毒属-单股正链RNA病毒-猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）,是一种在全球养猪业内广泛流行的肠道冠状病毒。PEDV具有高度接触性传染特性,各年龄段的猪只均可受其侵袭,哺乳期仔猪死亡率可达到90%～100%。PEDV的易变异特性及其与其他肠道病毒的共感染特性,为PED的诊断与检测、防控与治疗工作带来了巨大挑战,为我国和世界各地区的养猪业造成了极大的经济损失。基于实验室前期经串联质谱标签定量蛋白质组学技术（TMT）分析PEDV感染Vero细胞前后的差异宿主应答蛋白,本研究初步筛选了3个显著表达的差异宿主蛋白,探究了宿主蛋白对PEDV增殖的影响研究,这项工作不仅为揭示PEDV的致病机理及如何有效预防该病毒感染机制研究奠定了试验基础,而且也为宿主蛋白与病毒互作基础研究提供一个科学参考。TMT初筛获得的Vero细胞三种差异蛋白分别是鞭毛内运输蛋白（Intraflagellar transport protein 57,IFT57）、胚胎干细胞特异性5-羟甲基胞嘧啶结合蛋白（Embryonic stem cell-specific 5-hydroxymethylcytosine-binding protein,HMCES）、线粒体内膜蛋白29（Mitochondrial inner membrane protein 29,TIMM29）,分别构建真核表达质粒HA-IFT57-pc DNA3.1、HA-HMCES-pc DNA3.1和HA-TIMM29-pc DNA3.1,在Vero细胞和293T细胞验证表达情况。于Vero细胞中过表达上述真核表达质粒或利用si RNA干扰技术分别对Vero细胞内源性HMCES和TIMM29基因进行敲低处理,分别将MOI=0.5的PEDV CH/HNPJ/2017（GIIb）病毒感染Vero细胞,于病毒感染后不同时间点利用Western blot、q RT-PCR和TCID50方法分别检测PEDV N基因在蛋白水平、m RNA水平表达量变化及病毒滴度变化。此外,过表达TIMM29蛋白后检测了m TOR、IRF3和Ja K/STAT通路因子m RNA水平变化。本试验获得的主要结果如下:（1）Vero细胞转染HA-IFT57-pc DNA3.1质粒36 h后感染病毒,并于感染后6、12、18、24、30、36 h检测PEDV N在蛋白、m RNA水平和病毒滴度水平变化。Western blot、q RT-PCR与TCID50结果显示,过表达IFT57的试验组相比于转染pc DNA 3.1的对照组,PEDV N的蛋白水平、m RNA表达水平及病毒滴度趋势没有显著差异（P＞0.05）,试验结果表明IFT57对PEDV的复制没有影响。（2）Vero细胞转染HA-HMCES-pc DNA3.1质粒36 h后感染病毒,于病毒感染后0、6、12、24、36 h检测PEDV N基因在蛋白水平、m RNA水平及病毒滴度水平变化。Western blot和q RT-PCR结果表明,过表达HMCES试验组相比于pc DNA 3.1对照组,PEDV N蛋白和m RNA水平均显著升高（P＜0.05）。使用HMCES si RNA转染Vero细胞,敲低内源性HMCES基因表达,PEDV N的蛋白m RNA水平显著降低（P＜0.05）。剂量依赖结果表明,随着HMCES剂量的增加（0、0.5、1.5、3.0μg）,HMCES以剂量依赖型方式促进PEDV复制,TCID50结果也佐证了上述结果。试验结果表明HMCES以剂量依赖型方式促进PEDV在Vero细胞中的复制。（3）Vero细胞转染HA-TIMM29-pc DNA3.1质粒36 h后感染病毒,于病毒感染后0、12、24、30、36 h不同时间点检测PEDV N在蛋白、m RNA水平及病毒滴度水平变化。Westernblot和q RT-PCR结果显示,过表达TIMM29试验组相比于pc DNA 3.1对照组,PEDV N的蛋白水平和m RNA水平显著降低（P＜0.01）,过表达TIMM29蛋白对PEDV的复制起到抑制作用。使用TIMM29 si RNA转染Vero细胞,敲低内源性TIMM29基因表达,PEDV N的蛋白和m RNA显著升高（P＜0.01）。剂量依赖结果说明,随着TIMM29剂量的增加（0、0.5、1.5、3.0、5.0μg）,TIMM29以剂量依赖型方式抑制PEDV复制,TCID50结果也佐证了上述结果,试验结果表明TIMM29以剂量依赖型方式抑制在Vero细胞中的复制。（4）当Vero细胞过表达TIMM29时,与对照组相比,试验组的干扰素调节因子IRF1和IRF3 m RNA显著下调（P＜0.01）;VEGFA m RNA显著上调（P＜0.05）、AKT3m RNA显著下调（P＜0.01）;Ja K/STAT通路调节因子IL11和IL5 m RNA显著上调（P＜0.05）;γ-IFN下游受体IFNGR2和α/β-IFN受体IFNAR1 m RNA显著上调（P＜0.05）;Ja K/STAT通路上游调节因子Bal-2 m RNA表达量上调（P＜0.01）,Ja K/STAT通路下游调节因子Bax m RNA表达量下调（P＜0.01）。试验结果提示,TIMM29抑制PEDV复制过程中,雷帕霉素m TOR、干扰素调节因子IRF3和Ja K/STAT通路可能参与其中。