背景下腰痛作为一种临床常见病和多发病,已严重影响人们的劳动能力和日常生活,给社会经济和医疗带来严重负担。尽管引起下腰痛的原因很多,但是椎间盘退变是其中最重要的因素之一。目前临床上椎间盘退变性疾病的治疗方法主要有两大类：一类为保守治疗,主要包括卧床休息、药物治疗和理疗等,此类治疗方法虽具有费用少、患者易接受等优点,但存在症状反复的缺点；另一类为外科手术治疗,主要包括减压、融合和人工椎间盘置换等,这类治疗方法虽然短中期疗效满意,但长期随访发现会出现手术节段失稳和加速相邻节段退变等并发症。而且无论保守治疗还是手术治疗均为对“症”治疗,而非对“因”治疗,并不能从根本上促进退变的髓核再生从而修复椎间盘的退变。因此,探寻如何延缓甚至逆转椎间盘退变的治疗方法具有重要意义。随着生物学治疗在再生医学中的不断研究,探索椎间盘退变性疾病的生物学治疗方法已经成为国内外脊柱外科临床与基础研究者关注的热点。已有大量研究表明,生物学治疗包括细胞因子、细胞(干细胞、髓核细胞等)、支架材料等均可以通过提高髓核细胞的生物学活性,增加细胞外基质的分泌,从而促进退变的髓核再生,最终起到修复椎间盘退变的作用。然而,由于这些生物学治疗方法均存在不足之处,如细胞因子半衰期短、干细胞在椎间盘内恶劣的内环境下生物活性较低、支架材料生物活性不足且植入时可能会加重椎间盘退变等,所以进入临床实际应用尚存在较多困难和障碍。因此,构建一种可通过微创注入的组织工程髓核将这三者有机结合起来,将可能使得椎间盘退变性疾病的生物学治疗成为可能。自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料作为一种新型分子工程支架材料,由于其具有良好的生物相容性和生物活性,已广泛应用于组织工程、再生医学、细胞三维培养和药物的缓释等领域。RADA16-I (AcN-RADARADARADARADA-CNH)是一种新型可注射的自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料。它是由天然氨基酸合成,可通过微创方法注入体内后迅速形成大量纳米纤维,并立即自组装成水凝胶支架材料。这种纳米纤维支架结构与细胞外基质相类似,能够为组织细胞的三维培养提供良好的条件。此外,还可以通过在其C端末端复合上具有不同功能的短的生物活性多肽片段(一般不超过15个氨基酸片段)构建新型功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料,从而提高其生物学活性并达到与组织细胞特异性作用的目的。尽管功能化自组装多肽延长了RADA16-I的C末端后会影响自组装多肽原有的凝胶性,但当其与RADA16-I等体积混合后,又可以恢复原有的凝胶特性。目前基于RADA16-I这种生物学特性构建的新型功能化自组装多肽纳米纤维支架水凝胶材料已广泛应用与骨、神经、心肌和血管再生等领域。BMP7是TGF-β超家族中一种重要的细胞因子。既往研究表明,BMP7不仅体外可以促进髓核细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的分泌增加,而且体内可以通过增加细胞外基质的分泌修复椎间盘的退变。然而,由于BMP7具有半衰期短的缺点限制了其临床应用。完整的BMP7具有近400个氨基酸片段,难以通过化学键作用将其附合在纳米支架材料上从而延长其半衰期。近年来研究发现,SNVI (SNVILKKYRN)、KPSS (KPSSAPTQLN)和KAIS (KAISVLYFDDS)3个短活性片段具有BMP7的生物学活性,这为通过附合在纳米纤维支架材料上延长BMP7半衰期成为可能。因此,本研究拟将BMP7的3种不同短功能片段连接至RADA16-I的C末端构建3种不同的功能化自组装多肽纳米纤维支架水凝胶材料,并体外观察其对人退变髓核细胞的生物相容性和生物学活性。期望这种新型功能化自组装多肽纳米支架水凝胶材料不仅可以为人退变髓核细胞提供三维培养环境,而且还具有BMP7的生物学效应,并延长其作用时间,从而提高人退变髓核细胞的生物学活性,最终修复椎间盘退变。目的1、以RADA16-I为基础分别构建含有BMP7三种短功能片段的功能化自组装多肽；2、观察含有BMP7短功能片段的功能化自组装多肽材料的凝胶性能及结构特征;3、观察这三种功能化自组装多肽纳米纤维支架材料对人退变髓核细胞的生物相容性和生物学活性,并筛选出最佳的功能化自组装多肽纳米纤维支架材料；4、比较功能化自组装多肽纳米纤维支架材料和BMP7对人退变髓核细胞生物学活性的影响；5、体外观察利用含有BMP7短功能片段的功能化自组装多肽纳米纤维支架材料修复椎间盘退变的可行性。方法1、自组装多肽制备：首先利用化学合成法分别合成自组装多肽RADA16-I (AcN-RADARADARADARADA-CONH2)和含有BMP7不同短肽片段的功能化自组装多肽RSNV(AcN-RADARADARADARADA-GG-SNVILKKYRN-CONH2)、RKPS(AcN-RADARADARADARADA-GG-KPSSAPTQLN-CONH2)和RKAI(AcN-RADARADARADARADA-GG-KAISVLYFDDS-CONH2).利用超纯水制备成1%的溶液,超声震荡30分钟后过滤分装。然后再将功能化自组装多肽RSNV、RKPS和RKAI分别与RADA6-I等体积混合,制备成新的功能化自组装多肽纳米纤维支架材料RAD/SNV、RAD/KPS和RAD/KAI。2、水凝胶材料的制备：分别将100μL的1%多肽溶液加入transwell中,然后移入含有400μL基础培养基的24孔板中,再向材料表面加入100μL基础培养基,放入37℃培养箱中1小时后观察其能否自组装成水凝胶材料。3、材料结构特征观察：分别利用原子力学显微镜、圆二色光谱和扫描电镜观察多肽材料纳米纤维形成能力、二级结构及其超微结构特征。4、人退变髓核细胞的分离培养：选取腰椎间盘突出症患者取出的髓核组织,利用胶原酶消化法进行分离培养,传至第3代后用于本课题研究。5、人退变髓核细胞的三维培养：将收集到的第3代人退变髓核细胞利用10%无菌蔗糖水制备成2.5×106/mL的细胞悬液,再将20μL的细胞悬液迅速与100μL多肽溶液混合后加入transwell培养孔中。然后,将其移入含有移入含有400μL基础培养基的24孔板中,再向材料表面加入400μL基础培养基,放入37℃培养箱10分钟,之后每30分钟更换培养基一次,共3次。6、功能化自组装多肽纳米纤维支架材料对人退变髓核细胞的生物相容性观察：首先利用功能化自组装多肽纳米纤维支架材料对人退变髓核细胞进行三维培养,7天和14天后分别利用扫描电镜观察人退变髓核细胞在支架材料内部的粘附情况；1天、3天和7天后分别利用生存分析观察人退变髓核细胞在支架材料内部的存活情况。7、功能化自组装多肽纳米纤维支架材料对人退变髓核细胞的生物学活性观察：制备功能化自组装多肽纳米纤维支架材料,然后将人退变髓核细胞种植于支架材料表面,培养1天、3天和7天后分别利用激光共聚焦荧光显微镜观察细胞在材料表面粘附情况和向支架材料内部迁移情况。以单纯种植于培养板中作为阴性对照组,而在培养板中持续加入10ng/mL BMP7作为阳性对照组,将人退变髓核种植于多肽水凝胶材料内进行三维培养,1天、3天、5天和7天后利用CCK-8试剂盒检细胞在支架材料内的增殖情况；7天、14天和28天后分别利用Elisa试剂盒检测Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和蛋白多糖的分泌情况,利用qRT-PCR检测Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、X型胶原、蛋白多糖、Sox-9和多能蛋白聚糖的基因表达情况。结果1、自组装多肽水凝胶材料制备：BMP7短功能片段SNVI、KPSS和KAIS均可以通过固相合成法连接至RADA16-I的C端从而构建出功能化自组装多肽RSNV、RKPS和RKAI。所有功能多肽混合液RAD/SNV、RAD/KPS和RAD/KAI均可以在体外37℃条件下形成透明的水凝胶样材料。2、原子力学显微镜结果示：RADA16-I、RAD/SNV、RAD/KPS和RAD/KAI均可以形成大量纳米纤维样结构。其中RAD/SNV、RAD/KPS和RAD/KAI形成的纳米纤维直径均明显大于RADA16-I (P<0.05),但纳米纤维长度均从几百纳米到几微米。3、圆二色光谱分析示：RADA16-I、RAD/SNV、RAD/KPS和RAD/KAI均可以形成典型的β-折叠结构,即在216纳米处形成负波峰,195纳米处形成正波峰。但是RAD/SNV和RAD/KPS的峰值较RADA16-I低,而RAD/KAI的峰值较RADA16-I高。4、电镜扫描结果示：RADA16-I、RAD/SNV、RAD/KPS和RAD/KAI体外自组装成的纳米纤维均可以交织成孔隙样结构,其纳米纤维直径约10-40纳米,孔径约5-200米.这种特殊的结构与髓核细胞外基质结构相类似,有利于髓核细胞的营养交换。当人退变髓核细胞在这些支架材料内进行三维培养14天后,可发现髓核细胞通过伸出大量伪足紧紧的粘附在水凝胶支架材料的纳米纤维上,而且呈现三维立体样形态。此外,在细胞表面还可以观察到大量细胞外基质样的分泌物。5、细胞存活实验结果示：人退变髓核细胞在水凝胶支架材料内三维培养后,发现所有自组装多肽水凝胶支架材料对人退变髓核仅具有微弱的细胞毒性,并且随着时间的延长其细胞毒性并没有明显的增加(P>0.05)。三维培养7天后,各自组装多肽水凝胶支架材料内的人退变髓核细胞的存活率均大于86%。6、细胞迁移结果示：将人退变髓核细胞分别种植于RADA16-I、RAD/SNV、 RAD/KPS和RAD/KAI材料表面培养后,发现细胞均可以在水凝胶支架材料表面贴附生长,并呈长梭形。但培养7天后,可观察到RADA16-I和RAD/KAI表面的细胞量稀疏,而RAD/SNV和RAD/KPS表面的可以观察到大量的细胞集落。三维重建后,可以发现人退变髓核细胞均可以自发的向支架材料内部迁移,并与培养时间成正相关。培养7天后,发现细胞向RAD/SNV(290微米)和RAD/KPS(295微米)内部迁移的距离要明显大于RADA16-I(128微米)和RAD/KAI(169微米)。7、细胞增殖实验结果示：人退变髓核细胞在水凝胶支架材料内三维培养,发现随着培养时间的延长,细胞量不断增加。培养7天后,与阴性对照组相比,所有水凝胶支架材料内部的细胞量均明显增加(P<0.05),而在阴性对照组中加入BMP7后细胞量并没有明显变化(P>0.05)。各水凝胶支架材料相比,RAD/SNV和RAD/KPS的人退变髓核细胞量没有明显差异(P>0.05),但均显著高于RADA16-I和RAD/KAI组(P<0.05)。8、Elisa实验结果示：人退变髓核细胞在水凝胶支架材料内三维培养28天后,发现与阴性对照组相比,所有水凝胶支架材料内髓核细胞的Ⅱ型胶原蛋白和蛋白多糖的分泌量均明显增加(P<0.05),但均显著低于阳性对照组(P<0.05)；Ⅰ型胶原蛋白的分泌量均明显降低(P<0.05),但均显著高于阳性对照组(P<0.05)。各水凝胶支架材料相比,尽管RAD/SNV和RAD/KPS促进Ⅱ型胶原和蛋白多糖分泌和减少Ⅰ型胶原分泌的能力均明显优于其它各水凝胶支架材料(P<0.05),但是RAD/KPS蛋白多糖的分泌量又显著高于RAD/SNV(P<0.05),其余两组间无显著性差异(P>0.05)。此外,RAD/SNV和RAD/KPS促进Ⅱ型胶原和蛋白多糖分泌增加主要发生于前14天,而且能够至少维持28天。9、qRT-PCR检测结果示：人退变髓核细胞在水凝胶支架材料内三维培养28天后,发现与阴性对照组相比,所有水凝胶支架材料内髓核细胞的Ⅱ型胶原蛋白、蛋白多糖和Sox-9基因的表达量均明显增加(P<0.05),但均显著低于阳性对照组(P<0.05)；Ⅰ型胶原和多能蛋白聚糖的基因表达量均明显降低(P<0.05),但均显著高于阳性对照组(P<0.05)；X型胶原的基因表达量在各组之间均没有明显差异(P>0.05)。各水凝胶支架材料相比,尽管RAD/SNV和RAD/KPS提高Ⅱ型胶原、蛋白多糖和Sox-9基因表达的能力和降低Ⅰ型胶原和多能蛋白聚糖基因表达能力均明显优于其它各水凝胶支架材料(P<0.05),但是RAD/KPS蛋白多糖和Sox-9基因的表达量又显著高于RAD/SNV(P<0.05),其余各基因表达两组间无显著性差异(P>0.05)。此外,RAD/SNV和RAD/KPS促进Ⅱ型胶原和蛋白多糖分泌增加主要发生于前14天,尤其是前7天,而且能够至少维持28天。结论1、BMP7短功能片段可以连接至RADA16-I的C末端从而构建功能化自组装多肽；2、所有自组装多肽RADA16-I、RAD/SNV、RAD/KPS和RAD/KAI均可以体外生理条件下自组装成纳米纤维支架水凝胶材料；3、所有自组装多肽RADA16-I、RAD/SNV、RAD/KPS和RAD/KAI对人退变髓核细胞均具有良好的生物相容性；4、所有自组装多肽RADA16-I、RAD/SNV、RAD/KPS和RAD/KAI均对人退变髓核细胞具有良好的生物学活性,但均弱于BMP7对人退变髓核细胞生物学活性的影响,BMP7>RAD/KPS≥RAD/SNV>RAD/KAI≥RADA16-I;5、RAD/KPS具有类BMP7样生物学活性,且这种生物学活性至少能够维持较长时间。综上所述,RAD/KPS作为一种新型的可注射的功能化自组装多肽纳米纤维支架材料,有效的将生物学支架材料与BMP7有机结合起来,不仅可以为人退变髓核细胞提供细胞外基质样的三维培养环境,而且可以较长时间维持类BMP7的作用,为椎间盘退变性疾病提供了一种新的生物学支架材料。