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中国水仙(Narcissus tazetta var.chinensis)是石蒜科水仙属植物,我国十大传统名花之一。但中国水仙根为肉质须根,生长发育期需水量大,且可用于栽种水仙的良田大幅减少,因此,研究中国水仙应对干旱、盐碱等逆境胁迫应答过程,对拓宽水仙用途,扩大其栽种地域具有重要意义。本研究主要分为三个部分:第一部分为’云香’水仙非生物胁迫相关WRKY基因的克隆;第二部分主要检测’云香’水仙WRKY基因的组织特异性表达、时空特异性表达以及外源植物激素处理、非生物胁迫处理后的表达特征;第三部分为’云香’水仙WRKY基因过表达的转基因烟草的抗旱和抗盐能力初步分析。本研究结果为选育抗逆性的水仙新品种提供理论依据。主要研究结果如下:1.本研究基于课题组前期对’云香’水仙不同花期花瓣和副冠的转录组数据库,利用RT-PCR技术克隆了NtWRKYY1(GenBank登录号为 KX056495)和 NtWRKYY2(GenBank 登录号为 KX056496)基因,对其进行初步的生物信息学分析。氨基酸基本理化性质分析表明NtWRKYY1蛋白为酸性且不稳定的疏水性蛋白,NtWRKYY2蛋白为碱性且不稳定的亲水性蛋白。这2个蛋白为非分泌蛋白和非跨膜蛋白,以丝氨酸修饰为主导、苏氨酸或酪氨酸为辅的磷酸化修饰方式。亚细胞定位预测表明这2个蛋白定位在细胞核的可能性较大。序列比对和系统发育树分析表明NtWRKYY1基因属于Ⅱc类WRKY转录因子,NtWRKYY2基因属于Ⅱd类WRKY转录因子。2.实时荧光定量PCR结果表明NtWRKYY1和NtWRKYY2基因在’云香’水仙花中表达量显著高于根和叶,具有明显的组织特异性;时空表达分析结果表明在开花过程中的花瓣和副冠上NtWRKYY1和NtWRKYY2基因的转录水平基本呈现逐渐上升趋势,推测NtWRKYY1和NtWRKYY2基因可能参与’云香’水仙花朵衰老的过程;外源生长调节物质处理’云香’水仙叶片后的表达特性表明NtWRKYY1基因的表达受ABA诱导和MeJA抑制,而NtWRKYY2基因的表达受ABA、MeJA诱导;非生物胁迫处理’云香’水仙叶片后的表达特性表明NtWRKYY1和NtWRKYY2基因的表达可能受高温、干旱、盐的诱导。3.利用In-Fusion克隆技术构建了 pMDC140-NtWRKYY1和pMDC140-NtWRKYY2过表达载体,采用农杆菌介导的叶盘法进行烟草的遗传转化,通过PCR和GUS染色鉴定证明WRKY基因已经导入烟草基因组中,分别获得了转NtWRKYY1基因烟草T0代阳性苗3株,转NtWRKYY2基因烟草T0代阳性苗8株,收获T0代阳性苗种子后播种获得T1代阳性苗,对T1代转基因植株进行干旱和盐胁迫处理,结果显示,NtWRKY11和NtWRKYY2过表达的转基因烟草叶片萎蔫与黄化程度明显小于野生型烟草,研究表明NtWRKYY1和NtWRKYY2基因过表达的转基因烟草具有抵抗干旱和盐胁迫的能力。该研究为水仙抗旱和抗盐转基因育种提供备选目的基因,为进一步筛选WRKY候选基因转化水仙,以培育抗旱和抗盐性强,适应性广的中国水仙新品种奠定工作基础。