研究背景：全世界每年死于癌症的病人数以千万计,癌症严重威胁着人类的健康和生存。虽然每种恶性肿瘤可能由不同的病因引起并具有不同的症状,但是它们最重要的共同特征就是肿瘤细胞的恶性增殖。而细胞增殖又需要通过细胞周期来进行调控。在细胞周期调控中起着核心作用的是CDK/Cyclin复合物,CDK/Cyclin的活性受多种因子的调控,如Weel,CDC25等。CDC25是一种双特异性蛋白磷酸酶,它可以去磷酸化CDK/Cyclin复合物从而使其活化,参与细胞周期调节并调控应对DNA损伤,在正常的细胞周期中具有重要的作用。近来很多研究表明,CDC25在多种癌症组织中均呈现过表达,如结肠癌,肺癌,胃癌,乳腺癌,前列腺癌,肝癌等等,其过表达往往与肿瘤生成及癌症的预后不良有关。由于CDC25对细胞周期的调控作用以及在癌细胞中的异常表达,它已成为一个热门的癌症治疗靶点。近年来,许多类型的化合物被发现并证明在体外具有抑制CDC25磷酸酶活性的作用。这些化合物主要是以维生素K3及其衍生物为代表的醌源类化合物,另外还有喹啉二酮类化合物及萘醌类化合物等等。它们共同的特征是具有醌类结构,在细胞实验中可以诱导G1/S期和G2/M期的细胞周期阻滞。但是它们的效价可能因为醌还原酶而降低,并且严重的毒副作用和耐药性也限制了其开发潜力。故开拓思路、寻找新结构、新代谢途径的CDC25抑制剂势在必行。杂环化合物在有机药物中占有重要地位。大量的、结构多样性的杂环化合物的合成是发现具有生物学功能的化合物的源泉,尤其在抗肿瘤新药发现中具有重要的地位(宋宇宁,等,Curr Pharm Des.2013;19(8):1528-48.)。通过对近几年文献调研发现,芳杂环巯乙酸衍生物是具有广泛的生物活性的优势杂环结构,引起了我们的研究兴趣(宋宇宁,等,Med.[Chem.Commun.2013;4:810-816;宋宇宁,等,Curr Pharm Des.2013;19(40):7141-54.)。它们可以作为构成药效团的基本结构母核,通过刚性杂环及柔性巯烷链的协调匹配以适合药物特殊作用靶点的空间要求；还可以作为活性取代基或环系的组成部分而产生相应的生物活性；同时具有较好的体内代谢稳定性及生物相容性。因此它们近期被广泛应用于新型抗肿瘤先导化合物的发现及结构优化。根据上述分析及我们近几年在该类杂环化学及生物学方面的研究基础,为发现结构新颖的CDC25抑制剂,构建了含有60余个杂环巯基烷烃衍生物的小型化合物库,并对其进行活性筛选,发现嘧啶并咪唑巯乙酮类及嘧啶并咪唑巯乙酰胺类化合物这两大类结构具有较好的抗肿瘤活性,根据其结构特点,推测其可能是潜在的CDC25抑制剂。本文对筛选出的6个化合物(CHEQ-1～CHEQ-6)进行了进一步的活性测定,对其中药效最为显著的CHEQ-2(1-(3,4-二羟基苯基)-2-(1-(2,4,6-三甲基苯)-1H-咪唑[4,5-c]吡啶-2-巯基)乙酮),探讨了其对MCF-7、HepG2及HT-29三种细胞的体外抗肿瘤活性及其机制,并对其安全性及体内抗肿瘤活性进行了初步评价。研究目的：本研究对6个新型吡啶并咪唑巯烷类化合物进行评价,并对其中活性最佳的CHEQ-2的抗肿瘤活性进行进一步的研究,探讨其作用机制,对发现高效低毒且具有自主知识产权的新型CDC25抑制剂具有重要意义.实验方法：以OMFP为底物测定体外CDC25的磷酸酶活性,评价该系列化合物对CDC25A和CDC25B体外酶活性的抑制作用。选用人结肠癌细胞HT-29和人肝癌细胞HepG2,以MTT法检测了该系列化合物对肿瘤细胞增殖的抑制作用。对筛选出的活性较好的CHEQ-2,进一步测定其对其它多种不同类型肿瘤细胞生存率的影响,并与阳性化合物VK3以及XDW-1进行比较。用PI染色配合流式细胞术检测CHEQ-2对MCF-7、HepG2以及HT-29的细胞周期的影响,并用Western blotting法对周期相关蛋白的表达进行检测。Hochest33342染色法和流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染实验测定CHEQ-2对三种肿瘤细胞的凋亡诱导作用,Western blotting法检测凋亡相关蛋白Caspase-3,PARP,Bax以及Bcl-2的表达。用DCFH-DA染色和JC-1染色分别测定MCF-7、HepG2以及HT-29细胞中ROS和线粒体膜电位的变化,并用流式细胞术进行定量分析。用抗氧化剂NAC预处理细胞后再加入CHEQ-2进行作用,检测合用后ROS水平、线粒体膜电位的变化以及细胞生存率。一次性灌胃或腹腔给予小鼠2000mg/kg的CHEQ-2,观察2周内动物的急性毒性反应及体重变化。体内实验,将HepG2细胞接种于裸鼠腋下,检测CHEQ-2对肿瘤生长的抑制作用,进一步用Western blotting法检测了CHEQ-2对肿瘤组织中CDC25A、CDC25B、CDK2、Cyclin A、Cyclin B以及Cyclin E的调控作用。实验结果：该系列6个吡啶并咪唑类化合物对CDC25A和CDC25B的体外酶活性均具有一定的抑制作用,同时也在HT-29和HepG2细胞中表现出的良好的抗肿瘤细胞生长、增殖的作用。其中,CHEQ-2的酶抑制活性及抗肿瘤活性最佳,它可以抑制多种不同肿瘤细胞的生长、增殖,IC50值低于VK3和XDW-1。进一步研究发现,CHEQ-2可以下调CDC25A/B CDK2及Cyclin A、B、E的表达,诱导MCF-7、HepG2和HT-29细胞中的细胞周期阻滞,将细胞阻滞在S期。被阻滞在S期的细胞比例可达66.9%、63.7%及61.6%。CHEQ-2还可以诱导MCF-7、HepG2和HT-29细胞发生凋亡.Hoechst33342染色显示,经CHEQ-2处理48h后,细胞的细胞核染色质均出现不同程度的固缩浓染,有的细胞核甚至出现碎裂呈珠链状的现象。通过Annexin V/PI双染法定量检测发现,CHEQ-230处理组对三种细胞均作用显著,细胞凋亡率最高可达49.5%、45.7%和52.8%。通过Western blotting对凋亡相关蛋白进行测定,结果表明CHEQ-2可以激活MCF-7、HepG2和HT-29细胞中的Caspase-3及其下游底物PARP,使其活性形式增加。还可以增加促凋亡蛋白Bax的表达同时降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。另外,在加入DCFH-DA荧光探针后,在CHEQ-2处理过的细胞中可以观察到绿色荧光增多,荧光强度增强,表明细胞中ROS水平升高。流式细胞术结果显示,经CHEQ-230μM处理48h后,MCF-7、HepG2及HT-29三种细胞中的ROS水平分别升高33.3%、359.8%及78.2%。在加入荧光探针JC-1后,可以观察到阴性对照组的细胞呈红色荧光,说明其线粒体膜电位较高。而经CHEQ-230μM处理的三种细胞中分别有38.0%、72.7%及36.3%的细胞呈绿色荧光,表明这部分细胞的线粒体膜电位下降,线粒体功能受损。将CHEQ-2与抗氧化剂NAC合用,并对合用后细胞中的ROS水平、线粒体膜电位及细胞生存率进行检测。实验结果表明,NAC可以清除CHEQ-2刺激所产生的ROS,使之还原成正常水平,还可以消除CHEQ-2诱导的线粒体膜电位下降。另外NAC还可以拮抗CHEQ-2的抗肿瘤活性,提高肿瘤细胞的生存率。在加入CHEQ-2之前用5mM的NAC预处理细胞,MCF-7、HepG2及HT-29的细胞生存率由37.3%、15.5%及44.7%,分别上升至57.3%、48.9%及63.2%。急性毒性实验中,灌胃或腹腔给予小鼠2000mg/kg的CHEQ-2后,腹腔注射组有1只小鼠于给药4h后死亡,继续观察14d未见小鼠再有死亡。而灌胃给药组全部小鼠均无死亡现象。由此可见,腹腔给药及灌胃给药组LDso均高于2000mg/kg。同时对动物的体重数据进行分析发现,灌胃给药后对小鼠的体重没有明显影响,给药组与空白对照组相比没有显著性差异。而腹腔给药组在给药1d后,会出现7.5%轻微的体重下降,第2天即开始逐渐恢复。裸鼠实验表明,口服给予荷瘤小鼠CHEQ-210mg/kg每日1次,连续给药2周,可明显抑制HepG2肿瘤生长,抑制率可达43.0%,且对裸鼠体重无明显影响。Western blotting检测肿瘤组织蛋白显示,CHEQ-2可以抑制肿瘤组织中CDC25A、CDC25B及Cyclin B的表达,抑制率分别为51.3%、61.1%和64.1%。结论：以CHEQ-2为代表的吡啶并咪唑巯烷类化合物,具有较强的体内外抗肿瘤活性,通过抑制CDC25活性及表达,调控CDK-Cyclin复合物,从而导致细胞周期阻滞,遏制肿瘤细胞的恶性增殖。同时,CHEQ-2可以促进ROS生成,引起线粒体膜电位下降,经线粒体介导的凋亡通路诱导肿瘤细胞凋亡。另外,CHEQ-2在实验中表现出了低毒、高效的特性,极具药物开发潜力。