目的：肝病是影响人们健康的最重要的疾病之一，而肝癌又被称为“癌中之王”。在我国仅乙肝病毒携带者就有一亿多人，而其他病毒性肝炎、各种慢性肝病、肝硬化、中毒性肝病、酒精性肝病、自身免疫性肝病以及肝脏肿瘤等人数众多。因此，肝病的实验诊断就构成了医学实验诊断学的重要组成部分。然而，长期以来，临床上对肝细胞损伤的诊断更多地依赖于各种相关的酶学检查，如丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶等。尽管这些酶类能够在一定的程度上反映肝脏的损害，但是酶学的检测具有一定的局限性。首先，有些酶类并不是单一地反映肝脏组织疾病的进程，其他器官组织的疾病也可能出现肝脏相关酶类的变化；同时，许多反映肝脏相关疾病的酶类可以被诸多因素如药物、毒物等所诱导，难以反映肝脏疾病的真正变化趋势和程度。所以，长期以来，人们希望能够找到特异地反映肝脏细胞实质性损伤的诊断指标来准确地指导临床的治疗和判断预后。尽管肝脏的组织活检能够较真实地反映肝脏的损伤情况，但这一手段毕竟是一种有创的检查，难以被患者所接受。因此，找到一种即灵敏又特异地反映肝细胞损伤的简便的实验方法就成为我们的研究方向。 人肝脏F蛋白是一种组织特异性抗原(tissue Specific antigen，TSA)，它严格定位于肝脏细胞，其生物学功能尚不清楚。作为TSA的一种F蛋白在自身免疫性肝病与肝移植中的作用正逐渐被人们所认识。尤其重要的是，近年来F蛋白的基础研究表明，存在于肝脏组织细胞中的F蛋白浓度与血清F蛋白的浓度之间存在着巨大差异，同时其具有严格的组织特异性。F蛋白的这种特性奠定了它成为一种反映肝细胞损伤程度的灵敏和特异的指标的基础。 从80年代开始，人们研究血清F蛋白含量与肝脏疾病如急、慢性肝炎、肝癌和肝中毒所致肝损伤程度的关系，获得了一些临床数据。然而，F蛋白在临床检验上的应用遇到了障碍。主要的原因是F蛋白的来源难以保证，尽管有一些学者报道采用提纯的方法得到了F蛋白，但由于实验材料的获得比较困难、采用的分离提纯方法的不一致以及标准的不统一等等，导致学者们的结果难以相互验证，因此目前尚没有商品的F蛋白及其诊断试剂应用于临床。 为了使这一能够直接反映肝细胞损伤程度的生物学标志蛋白早日在肝病的实验诊断中发挥作用，满足临床的需要，本文试图采用分离提纯和基因工程的方法得到F蛋白，使这两种方法获得的F蛋白相互验证建立标准解决上述问题。因此，本文做了如下工作：人和大鼠肝脏特异F蛋白的克隆与表达、人肝脏组织F蛋白的提纯、 F蛋白诊断试剂的研制及其在临床检验上应用的初步探讨以及与肝脏肿瘤相关的C53蛋白在肝癌、胆管癌和肝纤维化组织中的表达等研究。 方法：论文第一部分，分别提取大鼠和人肝脏总RNA，确定其纯度和完整性后对其进行反转录和PCR(RT-PCR)扩增出目的基因(F—protein’s cDNA)，进行琼脂糖电泳检测目的基因，然后将大鼠和人的目的基因分别与pUCm—T载体进行连接获得克隆质粒pUCm-T-F并转化到大肠杆菌DH5α中；将结果正确的克隆片断与表达载体：pET-15b连接，获得F蛋白的表达质粒pET15b—F并将其转化到表达菌株BL21(DE3)pLysS中，用1mM IPTG诱导表达大鼠和人的目的蛋白，表达后的全菌蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，用Ni<2+>-charged IDA His—bind coluiiln对目的蛋白进行纯化，并最终用Western—blot进行鉴定。论文 第二部分，将取白手术来源的人肝脏组织，经低温匀浆、饱和硫酸氨沉淀粗提后再经DEAE—Cellulose 52、Sephacryl S-200和CM—Cellulose-23柱层析，最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。在人肝脏F蛋白提纯的过程中，每一步均经用BALB/c小鼠肝匀浆免疫C3H小鼠的抗F蛋白抗血清，进行F蛋白提纯过程的鉴定，分离过程中所选取的沉淀、层析各部分与小鼠抗F蛋白抗血清均出现抗原抗体反应的沉淀带。纯度鉴定采用SDS--聚丙烯酰胺凝胶电泳。 论文第三部分，用Ni<2+>—charged IDA HiSIbind column纯化的人肝脏F蛋白作为抗原免疫兔得到F蛋白的多克隆抗体；用间接ELISA法及Westem blot法分别对制备的多克隆抗体的效价和特异性进行测定；对用此多克隆抗体作为ELISA诊断试剂的指标进行分析；用此试剂检测收集的90例肝病患者(其中肝硬化39例、肝细胞癌15例、急性乙型肝炎21例、慢性乙型肝炎15例)、28例其他非肝脏疾病患者(心绞痛、糖尿病、脑梗塞、高血压)和32例新生儿血清与50例对照血清标本。 论文第四部分，选取来自天津市第三中心医院2005年4月至2007年2月期间住院并有明确临床诊断的肝脏肿瘤和肝纤维化患者组织标本，其中高分化肝细胞癌及癌旁组织各5例，中低分化肝细胞癌及癌旁组织各5例，肝内胆管癌及癌旁组织各5例，早期轻微肝脏纤维化5例。用近期文献特征的一个新的C53蛋白的抗体，采用常规修复方法进行免疫组化染色和镜检分析，探讨C53蛋白在各种类型肝脏肿瘤组织中表达的差异。 结果：第一部分，克隆与表达了大鼠F蛋白，表达后的全菌蛋白的SDS.PAGE电泳检测结果显示，目的带分子量约为43kD，与预期值相符；其表达量约为全菌总蛋白量的40％；表达的F蛋白与豚鼠抗人F蛋白多克隆抗血清呈阳性反应。人肝脏F蛋白的克隆与表达结果显示，目的基因为1134bp，与Gene-bank所提供的大鼠F蛋白基因编码序列大小相近。诱导表达后的全菌蛋白经SDS-PAGE电泳检测结果显示，其目的蛋白的大小约为43kD；Western-blot结果显示，表达的人肝脏特异F蛋白与豚鼠抗人F蛋白多克隆抗体发生了较强的免疫反应，提示，经基因工程方法得到的人F蛋白具有免疫活性，可用于后续的临床检验实验研究。 第二部分，人肝脏组织匀浆含总蛋白50427 mg，经离心和硫酸氨沉淀后获得了5468rag的粗制F蛋白，经DEAE-Cellulose 52、Sephacryl S-200、CM-Cellulose-23柱层析后分别获得1690、610和48mg F蛋白富集的蛋白组分。在人肝脏F蛋白提纯的过程中，对所得到的各蛋白组分分别用BALB/c小鼠肝匀浆免疫C3H小鼠的抗F蛋白抗血清进行鉴定的结果显示，均出现阳性免疫反应沉淀带。分离纯化后的F蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到了分子量为43 KD的优势条带，与文献报道的F蛋白分子量一致。 第三部分，用人肝组织来源克隆表达的F蛋白免疫兔所得的抗血清免疫效价可达1：25600，抗血清用于F蛋白检测试剂的灵敏度和免疫交叉反应的实验结果显示，其检测灵敏度达到0.5ug/孔(10 ug/m1)；批内重复性CV值在5.5％、批间重复性CV值在10％左右；F蛋白检测与HbsAg、HbeAg、HAV、HCV、HDV、HEV、HSⅥ、HSⅦ等抗原和大肠杆菌无免疫交叉反应；抗原和抗体反应时间1小时为最佳反应时间；该试剂在4。C，保存6个月后P/N比值下降15％左右，而且阳性血液标本稀释100倍其P/N比值仍在线性范围内。采用双夹心法分析人血清标本结果显示，39例肝硬化患者中有19例呈阳性反应，占48％；15例肝肿瘤患者中100％呈阳性反应；21例急性乙肝患者中90％呈阳性反应；15例慢性肝炎患者中30％呈阳性反应；非肝脏疾病患者(心绞痛、糖尿病、脑梗塞、高血压)共28例只有一例出现阳性结果；32例新生儿血清F蛋白结果均为阴性；50例正常对照血清标本中，有3例呈弱阳性反应，其余均为阴性，各组结果与正常对照比较具有统计学差异。第四部分，对肝肿瘤组织和肝纤维化组织切片进行免疫组化实验发现C53蛋白在肝癌组织中有较强表达(++以上)，在癌旁组织中有弱表达(+-)，在早期轻微肝纤维化组织中没有表达(-)。初步表明C53蛋白与肝脏肿瘤相关。 结论：用基因工程技术首次从人肝组织中克隆与表达了肝特异性F蛋白，在Gene-bank上发布了序列号为DQl88836的人肝F蛋白的cDNA序列。在此基础上从大鼠和人的肝脏克隆表达得到的F蛋白和从人的肝脏中提纯获得的F蛋白的分子量与文献报道一致。提示在不同种属动物中F蛋白功能的相似性。 克隆表达的大鼠F蛋白、人F蛋白与人肝脏组织纯化的F蛋白免疫豚鼠所获得的抗人F蛋白多克隆抗体均具有较强的免疫反应，表明所克隆的大鼠和人的F蛋白均具有人肝脏F蛋白的免疫活性。 本文所选用的分离提纯方法是在综合了前人的工作经验基础上确定的，尤其是小鼠抗F蛋白抗血清在分离过程中的使用使得整个提纯过程更加严谨。提纯的F蛋白与克隆得到的F蛋白的相互验证使F蛋白的系统研究工作更加完善，也进一步证明了F蛋白的肝脏特异性。 采用克隆人肝脏特异F蛋白免疫兔所得到用于临床使用的多克隆F蛋白抗血清作为诊断试剂，其灵敏度和特异性能够初步满足临床分析各种肝病患者标本的需要。分析结果显示，F蛋白这一指标对肝病的诊断具有一定的临床意义。提示，随着F蛋白诊断方法的完善，F蛋白这一指标将变得更加重要。 首次探讨了C53蛋白在肝脏肿瘤和肝纤维化组织中的表达，初步的研究结果发现这一蛋白与肝脏肿瘤相关。结合文献报道的C53蛋白在多种肿瘤组织的表达现象提示，C53在G2/M期作为DNA损伤检查蛋白对细胞周期起调节作用，可能是一种重要的新的肿瘤特异性或相关性抗原。