杆状病毒表达系统(Baculovirus expression vector system,BEVS)是目前最具应用价值的商业化表达系统之一。昆虫细胞作为其中重要组成之一,已有两个应用最广泛的商业化细胞系,草地贪纹夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞系Sf9和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)胚胎细胞系BTI-Tn-5Bl-4(High Five)。虽然昆虫细胞的悬浮培养技术已经比较完善,但是利用BEVS进行外源蛋白重组表达过程中仍然存在细胞活力低、细胞增殖不稳定以及细胞衰退等问题,对后续重组杆状病毒制备和外源蛋白表达非常不利。本课题从昆虫细胞摇瓶培养出发,对细胞培养及重组杆状病毒制备的基本工艺进行了优化,并在此基础上建立了人源甲状腺过氧化物酶(Human throid peroxidase,hTPO)和禽腺病毒纤维蛋白2(Fiber-2)的表达工艺,为优化基于杆状病毒表达系统的重组蛋白生产工艺提供了技术支撑。首先,在100 ml摇瓶中进行Sf9和High Five细胞的悬浮培养工艺优化,从常用的商业化培养基中筛选出最适培养基IB-905。在此培养基中,确定了 Sf9及High Five细胞的最适传代密度、传代周期及最适装液体积。同时High Five细胞具有高耗氧特性,摇瓶培养阶段需用带0.22 μm透气膜封口,以便进行气体交换。此外,两种细胞连续传代过程中,在IB-905中添加1%胎牛血清可有效延缓细胞衰退。其次,构建了 MultiBac-hTPO重组杆状病毒,比较了病毒感染后静置和悬浮两种培养方式以及不同储存条件对病毒滴度的影响。实验结果表明,在培养方式方面,以悬浮方式增殖病毒、感染后120 h收获病毒可获得最佳病毒滴度:在病毒保存方面,P3代病毒于4℃避光储存3个月,其滴度没有明显降低。而在-80℃储存一段时间后,病毒滴度降低50-80%,降低程度与病毒储液中添加的血清浓度有关。最后,选择分泌蛋白hTPO和胞内蛋白Fiber-2进行了重组蛋白生产条件优化,分别确定了最适表达宿主、感染复数、感染时间和感染前细胞密度。结果表明,两种蛋白在High Five细胞中的表达量均高于Sf9细胞。表达hTPO的最佳感染复数及感染时间分别为0.1和96 h;表达Fiber-2最佳感染复数及感染时间分别为0.1和72 h。对两种蛋白表达,病毒感染High Five时,最佳细胞密度均为1.5×106 cells/ml。在优化后的蛋白表达条件下生产两种蛋白,其中hTPO蛋白经亲和纯化后,纯度达到90%以上,hTPO特异性抗体检测显示出良好的反应原性。Fiber-2蛋白样品经特异性Ⅰ群禽腺病毒标准阳性血清检测,具有较好的抗原活性,并且抗原效价达到1:128倍,在开发Ⅰ群禽腺病毒亚单位疫苗方面具有良好的应用价值。