强心甙类药物能与真核细胞膜钠钾ATP酶(Na+/K+-ATPase)特异性结合，抑制该酶的活性，因此多年来被用于充血性心力衰竭和心律失常的治疗。越来越多的研究表明Na+/K+-ATPase抑制剂对多种器官组织来源的肿瘤有较好的抑制活性，但其作用机制并未得到全面深入的阐释。肺癌是当今世界发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一，而非小细胞肺癌(NSCLC)则约占肺癌发病的80％。在本研究中，我们以植物来源的地高辛和哇巴因作为代表性的强心甙类药物，采用人非小细胞型肺癌细胞作为强心甙类药物的作用对象，主要在A549和H460细胞中进行研究，探讨地高辛或哇巴因诱导人非小细胞肺癌细胞自噬发生的条件及其相关信号通路变化，并研究自噬与药物引起的抗肿瘤活性之间的关系。　　 首先我们采用MTT法检测两种药物分别对肿瘤细胞的生长抑制作用，发现该类药物在纳摩尔水平就能有效地抑制多种人非小细胞肺癌细胞系生长，且其抗肿瘤活性是顺铂的104倍。荧光定量PCR检测Na+/K+-ATPaseα3与α1亚基基因表达，发现α3/α1比值可能与强心甙类药物的抗肿瘤活性相关。我们在半数抑制浓度(IC50)范围进行下一步机制研究。流式细胞术发现两种药物在该浓度下，引起A549或H460细胞部分G2/M期阻滞；除哇巴因处理的H460组Sub-G1的细胞比例约占13.2％外，两种药物诱导的Sub-G1比例均在5％以下。同时，Hoechst33342染色观察到的细胞核型变化和westernblotting检测凋亡标志蛋白PARP的结果均说明在此浓度下，该类药物较少引起细胞凋亡。　　 进一步的研究采用PBS饥饿作为自噬的阳性对照组，发现强心甙类药物处理与饥饿组出现相似的自噬相关表型变化。在地高辛或哇巴因短时间作用下，westernblotting检测到自噬标志蛋白LC3-Ⅱ表达显著升高，自噬相关蛋白Atg5/12复合物和Beclin1的表达也明显增加；利用吖啶橙染色观察到细胞胞质中出现酸性空泡；电子透射显微镜检测到胞质中自噬体和自噬空泡的形成，并通过荧光显微镜捕捉到GFP-LC3质粒转染后细胞内出现的点状凝集现象，其中地高辛或哇巴因作用A549细胞后GFP-LC3阳性细胞分别约占17.3％或16.0％，阳性率较正常对照组显著增加(P＜0.01)。机制研究显示该类药物通过上调AMPK活性以及TSC2蛋白表达水平，有效地抑制mTOR信号通路，尤其对mTOR下游分子4E-BP1的抑制作用强于S6K1，而mTOR的另一个上游分子Akt的活性在药物处理后没有明显变化。此外，本研究结果显示强心甙类药物能够激活由Src介导MEK1/2/ERK1/2信号通路，该通路对药物诱导的细胞自噬起着正调节作用。我们给予自噬抑制剂或是对信号通路相关蛋白进行siRNA干扰发现，这些干预手段可显著逆转药物诱导的细胞自噬表型包括LC3-Ⅱ表达降低、GFP-LC3点状凝集细胞数减少以及信号通路变化。同时研究结果发现自噬表型的逆转导致药物抗肿瘤活性降低，提示药物诱导的自噬发挥着抗肿瘤作用。此外，我们初步研究了强心甙类药物激活的激酶通路之间的相互关系，发现Src蛋白处于AMPK上游，介导了药物诱导的AMPK活化，而ERK1/2激酶则处于AMPK下游。　　 综上所述，强心甙类药物对人非小细胞肺癌细胞系具有显著的抗肿瘤活性，在IC50浓度范围，该类药物一方面诱导细胞发生周期阻滞；另一方面通过调节AMPK/mTOR和Src/ERK1/2双重信号通路诱导人非小细胞型肺癌细胞发生自噬，这种自噬作用至少部分解释了药物的抗肿瘤活性。本研究从另一新颖角度深入阐释了靶向Na+/K+-ATPase的强心甙类药物的抗肿瘤机制。