从细胞生物学角度看，肿瘤发生发展的基本机制不外乎是细胞分化异常、增殖过剩和凋亡障碍。失控性生长和增殖及细胞凋亡受阻是恶性肿瘤细胞的重要特征。因此，抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化与凋亡，从而使肿瘤细胞消亡或消除肿瘤细胞对机体的危害，是针对肿瘤发生和演变的关键环节而设计的治疗方法，具有广阔的发展前途。控制细胞增殖、分化和凋亡的信号转导系统异常是细胞转化、演进和肿瘤发生的关键，控制肿瘤细胞的异常信号转导可控制恶性肿瘤的生长。细胞内许多信号通路转导异常均可促进肝癌细胞增殖、抑制肝癌细胞凋亡；阻断或抑制肝癌细胞异常信号转导可调节基因表达，抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡。 磷酸肌醇信号通路转导能力增强，表现为细胞内PI(phosphatidylinositol，PI)激酶、PIP(phosphatidylinosito1-4-phosphate，PIP)激酶、PLC(phosphoinositidase C，PLC)活性增强和第二信使分子IP<,3>(Inositoll,4,5-trisphosphate )和DG(diacyl glycerol)产生增加，在恶性肿瘤的生长、增殖和演进中起重要作用。抑制肿瘤细胞内PI激酶和PIP激酶活性，可导致细胞IP<,3>产生下降、细胞增殖能力下降甚至引起细胞死亡。但抑制磷酸肌醇通路信号转导能否诱导肝癌细胞凋亡目前尚不清楚；如能诱导肝癌细胞凋亡，其诱导细胞凋亡的分子生物学机制如何目前尚不清楚。 本研究旨在探讨磷酸肌醇信号通路抑制剂genistein和quercetin对肝癌HepG2细胞系p53和caSpase-3基因表达的调节作用及其在诱导肝癌细胞凋亡中的作用，为临床应用磷酸肌醇通路抑制剂治疗肝细胞癌提供理论和实验依据。 目的： 探讨磷酸肌醇信号通路抑制剂三羟异黄酮genistein)和五羟黄酮(quercetin)能否调节HepG2细胞p53和caspase-3基因表达，进而诱导细胞凋亡。 方法： 1．实验分组及处理 (1)药物诱导凋亡的剂量依赖性实验： 在培养HepG2细胞RPMI 1640培养基中加入0.8％DMSO(V／V)培养72h为0对照。Genistein组：在培养HepG2细胞RPMI 1640培养基中分别加入用DMSO溶解的20μmol／L、40μmol／L、60μmol／L、801μmol／L genistein。Quercetin组：在培养HepG2细胞RPMI 1640培养基中分别加入用DMSO溶解的20μmol／L、40μmol／L、60μmol／L、80μmol／L quercetin。各个培养基中DMSO的终浓度为0.8％(V／V)，所有细胞均培养72h，取细胞进行相关检测。 (2)药物诱导凋亡的时间依赖性实验： 在培养HepG2细胞RPMI 1640培养基中加入0.8％DMSO(V／V)培养72h为0对照。Genistein组：在培养HepG2细胞RPMI 1640培养基中加入601μmol／L genistein。Quercetin组：在培养HepG2细胞RPMI 1640培养基中加入601μmol／L quercetin。各组细胞分别培养12h、24h、48h、72h，按时取细胞进行相关检测。 2．指标检测：应用IP<,3>-[H<3>]Birtrak Assay试剂盒检测IP<,3>含量；RT-PCR方法分析细胞p53 mRNA和caspase-3 mRNA表达，结果拍照并进行半定量分析；western-blotting方法测定caspase-3蛋白表达，结果拍照并进行半定量分析；Fura-2双波长荧光检测技术测定细胞内游离钙离子浓度；流式细胞仪检测细胞凋亡率。 3．统计分析：所有实验均重复3次。数据均以x±s表示，采用统计软件sPss12.0进行单因素方差分析和相关分析。P<0.05为具有显著性差异。 结果： 1.IP<,3>含量变化 随着genistein和quercetin浓度的增加和作用时间的延长，各组IP<,3>含量逐渐降低，呈一定的浓度和时间依赖性。 各浓度genistein组HepG2细胞IP3含量均显著低于对照组[(P＜0.01)。(17.7＋1.3)(11.2±0.9)pmol/10<6>cells，(4.9±0.5)pmol/10<6>cells，(4.8±0.3)pmol/10<6>cells<,vs>(29.4±0.5)pmol/10<6>cells]，各浓度quercetin组HepG2细胞IP<,3>含量均显著低于对照组[(P＜0.01)。(17.9±1.5)pmol/10<6>cells，(15.5±1.1)pmol/10<6>cells，(5.7±0.9)pmol/10<6>cells，(5.5±0.8)pmol/10<6>cells VS(29.4±0.5)pmol/10<6>cells]。60μmol/L genistein组各时相HepG2细胞IP<,3>含量均显著低于对照组[(P＜0.01)。(7.5±0.8)pmol/10<6>cells，(5.6±0.5)pmol/10<6>cells，(4.3±0.6)pmol/10<6>ceils<,vs>(29.2±0.6)pmol/10<6>cells]；60pmol/L quercetin组各时相HepG2细胞IP<,3>含量均显著低于对照组[(P＜0.01)。(16.8±1.1)pmol/10<6>cells，(10.0±1.8)pmol/10<6>cells，(7.3±1.2)pmol/10<6>cells，(4.9±0.5)pmol/10<6>cells ads(29.2±0.6)pmol/10<6>cells]。2．RT-PCR结果半定量RT-PCR分析显示：genistein和quercetin达60μtrnol/L以上时，HepG2细胞P53 mRNA和caspase 3 mRNA表达显著高于对照组(P＜0.05)。 60μmol/L genistein和60μmol/L quercetin分别作用于HepG2细胞24 h后细胞P53 mRNA和caspase 3 mRNA表达显著高于对照组(P＜0.05)。 3．Western-blotting结果 半定量Western-blotting分析显示：genistein和quercetin浓度达60μmol/L以上时HepG2细胞caspase 3蛋白表达均显著高于对照组(P＜0.05)。60μmol/L genistein作用于HepG2细胞48h和60μmol/L genistein作用于HepG2细胞24h caspase 3蛋白表达均显著高于对照组(P＜0.05)。 4．Ca<2＋>浓度 genistein和quercetin在浓度40μmol/L以上时ca<2＋>浓度均显著低于对照组(P＜0.01)。60μmol/L genistein和60μmol/L quercetin作用于HepG2细胞各时相Ca<2＋>浓度均显著低于对照组(P＜0.01)。 5．细胞凋亡率 随着药物浓度的增加和作用时间延长，凋亡峰逐渐升高，HepG2细胞凋亡率逐渐增加，呈现一定的浓度和时间依赖性。 各浓度genistein组HepG2细胞凋亡率均显著高于对照组[(P<0.01)。(10.14±0.9)％，(18.74±1.6)％，(28.7±2.5)％，(27.9±2.0)％VS(2.6±0.1)％]；各浓度quercetin组HepG2细胞凋亡率均显著高于对照组[(P<0.01)。(11.2±1.1)％，(15.5±1.1)％，(26.8±2.5)％，(27.1±1.5)％VS(2.6±0.1)％]。 601μmol／L genistein组HepG2细胞24h后各时相凋亡率均显著高于对照组【(P<0.01)。(7.4±0.5)％，(20.5±2.0)％，(30.7±1.6)％VS(2.6±0.1)％】；60μmol／Lquereetin组HepG2细胞24h后各时相细胞凋亡率均显著高于对照组[(P<0.01)。(11.7±0.8)％，(14.3±0.7)％，(25.6±2.4)％VS(2.6±0.1)％】。 结论： 1、Genistein和quercetin可抑制肝癌HepG2细胞磷酸肌醇通路信号转导，导致IP<3>产生下降，诱导细胞凋亡。 2、抑制细胞磷酸肌醇通路信号转导可调节细胞内Ca<2+>浓度，进而上调P53 mRNA表达、上调caspase 3 mRNA和蛋白表达，诱导肝癌HepG2细胞凋亡。