类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以T细胞浸润关节滑膜为特点引起关节滑膜慢性炎症的自身免疫疾病，可导致软骨破坏和骨侵蚀。目前，关于慢性炎症的维持及其引起的组织损坏的机制尚不明了。研究发现，RA患者体内存在针对Ⅱ型胶原(typeⅡ collagen,CⅡ)、软骨糖蛋白以及许多特异性关节抗原的自身反应性T细胞及自身抗体与RA发病相关。存在于活动性RA关节组织中的CⅡ特异性T细胞(collagen typeⅡ antigen specific T cells，CⅡ-AST)参与维持RA炎症过程。一些关节炎的动物模型常被用来探索滑膜炎的发病机制，如胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型。这种实验性自身免疫病在易感性的啮齿类（大鼠和小鼠）动物体内通过用CⅡ诱导可发生自身免疫介导的多关节炎，与人类RA在临床症状、组织学及免疫学上有许多共同点。啮齿类动物对CIA的易感性与主要组织相容复合物Ⅱ类分子(MHCⅡ)相关。CⅡ引发的免疫反应以CⅡ-AST的活化和产生特异性的高滴度抗体为特点，这些都与人RA极为相似。CIA和RA之间的相似性使其广泛应用于RA的实验研究中。　　研究目的:　　建立小鼠CIA模型，研究CⅡ-AST的阳性率，探索其与CIA小鼠关节炎症指数、炎症细胞因子及自身抗体产生的相关性。通过量子点(quantum dots，QDs)标记CⅡ短肽活体示踪与免疫组织化学技术寻找CIA小鼠关节滑膜炎症部位特异性T细胞和B细胞存在的证据，阐明CⅡ-AST在CIA疾病发生中的作用。　　研究方法:　　在构建CIA小鼠模型的基础上，采用QDs标记链酶亲合素（QD705-SA）结合生物素化的CⅡ短肽对CⅡ-AST进行体外标记，建立CⅡ-AST的流式细胞分析技术(flow cytometry，FCM)，并研究CⅡ-AST阳性率。ELISA法检测CIA小鼠血清抗CⅡ短肽抗体、抗CⅡ全分子抗体、抗CCP抗体水平，探索CⅡ-AST与CIA小鼠关节炎症评分、炎症细胞因子(IL-4、IL-17、IFN-γ)、自身抗体水平的相关关系。通过QDs标记CⅡ短肽(QDs-SA-Bio-CⅡ)尾静脉注射途径，研究其在CIA小鼠体内的荧光分布特征，探索可识别CⅡ短肽的抗原特异性淋巴细胞（特异性T、B细胞）的迁移途径和组织，最后采用免疫组织化学技术研究CIA小鼠关节滑膜组织特异性T、B细胞存在的组织细胞学证据。　　研究结果:　　1.成功建立基于QDs标记的检测CⅡ-AST的FCM技术平台，并用于CⅡ-AST检测，结果以CD4+CD8-CⅡ-TCR+细胞为CⅡ-AST。研究结果发现:实验组CIA小鼠CⅡ-AST阳性率(2.351％)显著高于对照组小鼠(0.153％)和对照肽(0.147％)，差异具有统计学意义(P＜0.001)。CIA小鼠血清抗CⅡ短肽抗体、抗CⅡ全分子抗体、抗CCP抗体水平均较对照鼠显著增高（P＜0.01）。同时，CIA小鼠IL-17水平较对照鼠增高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。IFN-γ水平也增高，IL-4水平降低，但均无统计学意义。相关分析结果表明，CIA小鼠CⅡ-AST阳性率与关节炎症指数、抗CⅡ短肽抗体、抗CⅡ全分子抗体、抗CCP抗体水平以及IL-17水平均呈显著正相关关系（r分别为0.883、0.846、0.796、0.875和0.769，P均＜0.01），未发现其与IL-4、IFN-γ水平间存在相关关系。　　2.将QDs-SA-Bio-CⅡ经尾静脉注射到CIA小鼠体内，通过小动物成像分析系统进行示踪研究，观察其在CIA小鼠体内的荧光分布特征。结果在CIA小鼠关节炎症部位定位到与CⅡ短肽相关的特异性阳性信号。这有可能是抗原特异性T、B细胞识别QDs-SA-Bio-CⅡ并将其聚集于关节滑膜所致。注射QDs-SA-Bio-CⅡ20min后，CIA小鼠关节炎症部位荧光开始增强，2h后荧光强度最高，并维持到4h左右。之后荧光强度开始逐渐减弱，6h之后基本回到背景荧光水平。注射QDs-SA-Bio-CⅡ的实验组CIA小鼠在20min、2h和4h时关节炎症部位荧光强度的平均数分别为4.21×105 Photons/s/cm2/sr，5.36×105Photons/s/cm2/sr和1.96×105 Photons/s/cm2/sr，明显高于同时间点对照组(P＜0.05)。各脏器荧光成像分析显示，与注射生理盐水的对照鼠比较，注射QDs-SA-Bio-CⅡ6 h之后的CIA小鼠肝脏荧光强度较高，其他器官（心、肾、脾、肺）的荧光强度则相对较低。　　3.组织病理学分析发现，与对照组小鼠比较，CIA小鼠关节滑膜和关节腔中可见大量的单个核细胞浸润，通过En Vision二步染色法可见到CD4+T细胞和CD19+B细胞，而对照小鼠未观察到该类细胞群的存在。同时，利用QDs免疫荧光组织化学技术初步检测到CIA小鼠关节滑膜中IgG类膜表面Ig的B细胞，但并未检测到CⅡ-AST。　　结论:　　成功建立了基于QDs标记CⅡ-AST的FCM，发现CIA小鼠CⅡ-AST阳性率显著增高，并与关节炎症指数、相关自身抗体及细胞因子产生密切相关。在关节炎症部位发现有针对CⅡ短肽的特异性阳性荧光信号，并存在有CD4+T细胞、CD19+B细胞及IgG类B细胞的组织学证据。研究结果有助于对RA发病机制的新认识，并为后续研究奠定了重要的方法学基础。