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应激是机体对内外环境各种应激原刺激作用所产生的一种全身性的非特异适应性反应。在社会高速发展的今天,应激是机体存在的一种普遍性生物学现象,紧张的工作和生活节奏、消极的人际关系、突发性的灾害及重大生活事件均可作为应激原使机体发生病理生理学变化。经过长期的进化,生命体形成了完整的高度保守的调节系统,即由神经内分泌、免疫和心血管等机体多系统在内组成的可以应对机体内外应激原作用并作出适应性反应的应激系统。机体适度的应激属于正常的生理现象,但如果应激程度过强或持续时间过长,则可导致神经系统、心血管、内分泌和自身免疫疾病等一系列机体损伤,甚至死亡。应激可导致机体全身性的内分泌改变,其中下丘脑-垂体-肾上腺皮质(Hypothalamus-pituitary-adrenal,HPA)轴和蓝斑-交感-肾上腺髓质(Locus ceruleus norepinephrine axis,LC/NE)轴在机体应激反应中起核心作用。当机体受到内外应激原刺激时,下丘脑被激活可以通过HPA轴促进肾上腺皮质合成和释放糖皮质激素(Glucocorticoid,GC),LC/NE轴兴奋可以促进肾上腺髓质增加肾上腺素(Epinephrine,E)和去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)的分泌。GC、E和NE的分泌有利于机体动员能量和调节代谢变化从而增强机体抵抗内外界危险因素造成的影响。但是高强度的应激可使机体的自适应调节能力发生失代偿,导致机体出现不同程度的行为异常、功能障碍及病理性损伤。内质网应激本质上是应激过程中组织细胞内发挥的一种自我保护机制,但是高强度的应激导致的持续的内质网应激也可造成组织细胞的损伤甚至死亡。当前的研究显示内质网应激在多种神经退行性疾病和外伤性脑损伤导致的细胞死亡及其发病机制中起重要作用。作为细胞内参与合成、修饰、折叠及分泌蛋白质的重要细胞器,内质网的蛋白合成过程受到多种调控蛋白分子、蛋白折叠催化酶、内质网内外Ca2~+水平等众多因素的调节。正常情况下,内质网蛋白折叠能力总是与机体蛋白合成能力相匹配的。当机体受到一系列外界因素刺激时,细胞会出现低糖、缺血缺氧、体内钙离子水平失衡或调节因子及激素水平紊乱,可导致内质网氧化还原稳态失衡和Ca2~+水平紊乱,从而引起内质网内未折叠蛋白或错误折叠蛋白的堆积,引发内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS),并激活机体的适应机制来应对,即未折叠蛋白反应(Unfolded protein response,UPR)。Ⅰ型跨膜蛋白激酶(Inositol requirement 1,IRE1)和双链RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶(PKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK),作为内质网应激的重要感受元件和主要的损伤通路启动因子,当内质网应激发生时,二者与热休克蛋白家族(Heat shock Proteins,HSPs)的糖调节蛋白78(Glucose-regulated protein 78,GRP78)分离进而激活下游信号通路,通过减少蛋白质的翻译和促进伴侣蛋白的生成,促使内质网恢复稳态。但是当机体处于过强或者较长时间的应激时,应激细胞也可以通过PERK和IRE1分别激活转录激活因子4(Activating transcription factor 4,ATF4)和细胞凋亡信号调节激酶1(Apoptosis signal regulating kinase 1,ASK1),进而促进生长抑制因子(Growth arrest and DNA-damage-inducible gene 153,CHOP)和c-Jun氨基酸末端激酶(c-Jun amino-terminal kinase,JNK)的表达上调,二者的持续表达可以诱导细胞的损伤。本研究团队前期研究结果显示应激可以导致各脏器组织细胞出现损伤。作为应激反应最重要的脑区,目前下丘脑在不同时程应激刺激下的病理性损伤改变及其损伤机制,尚无系统详细的研究。因此本研究模拟人类应激时的生理和心理状态,建立了不同时程束缚加冰水游泳复合应激大鼠模型,检测应激相关激素及受体的变化,观察应激大鼠行为学改变,并从病理学角度探究应激对大鼠下丘脑神经细胞的影响,同时对内质网应激PERK-ATF4-CHOP和IRE1-ASK1-JNK信号通路相关蛋白在应激导致的神经损伤中的变化规律及相关机制进行探讨,旨在深入探究应激导致机体损伤的发病机制,揭示应激性损伤形态学改变。第一部分不同时程应激大鼠模型的建立及病理学观察目的:建立不同时程的束缚加冰水游泳复合应激大鼠模型,通过酶联免疫吸附(Elisa)实验、旷场实验、常规HE染色、免疫组织化学染色及组织化学特殊染色(硫堇和焦油紫染色),观察不同时程应激对大鼠下丘脑神经细胞的影响。方法:1. 建立每天束缚6小时后强迫冰水游泳5min的应激大鼠模型。通过观察大鼠体重和旷场行为学变化,确认成功建立不同时程应激大鼠模型。2.Elisa实验检测应激大鼠血清应激相关激素及其受体、HSP70的水平变化。3.HE染色观察不同时程应激大鼠下丘脑的病理学改变。4.小胶质细胞特异性标记物(IBA1)检测应激大鼠下丘脑小胶质细胞增生变化规律。5.硫堇染色和焦油紫染色观察不同时程应激大鼠下丘脑神经细胞尼氏体及形态改变。结果:1. 随着时间延长,对照组大鼠体重不断增加;与对照组相比,应激组大鼠体重增长速度明显下降(P<0.05),并且在1d、3d时体重显著降低。与对照组相比,应激组大鼠在旷场内排便次数数明显增加,中央区运动距离和中央区运动时间明显降低。2.Elisa实验结果显示应激大鼠血清的应激相关激素及其受体和HSP70水平出现显著动态变化。3.HE染色结果显示随着应激时间的延长,下丘脑出现组织水肿、胶质细胞增生,细胞固缩等病理性改变。4.IBA1免疫组织化学染色结果显示,应激14d、21d组大鼠下丘脑小胶质细胞出现增生、体积变大、突起减少等激活改变。5.硫堇和焦油紫染色实验结果显示应激大鼠下丘脑出现组织轻度水肿、神经细胞水肿、尼氏体固缩甚至变性坏死等病理性改变。小结:本部分实验在成功建立不同时程应激大鼠模型的基础上,通过HE染色、IBA1免疫组织化学染色、硫堇和焦油紫特殊染色得出如下实验结果:随着应激时间的延长,应激大鼠下丘脑出现组织水肿、小胶质细胞增生和激活、神经细胞尼氏体固缩甚至变性死亡等病理性改变,提示应激可导致下丘脑神经细胞损伤甚至变性死亡。第二部分PERK-ATF4-CHOP和IRE1-ASK1-JNK信号通路参与应激大鼠下丘脑神经细胞损伤过程目的:应用PERK磷酸化抑制剂和IRE1磷酸激酶抑制剂建立7d应激大鼠模型,系统观察下丘脑病理学改变及PERK-ATF4-CHOP和IRE1α-ASK1-JNK信号通路相关m RNA和蛋白的表达变化,探究内质网应激是否参与应激大鼠下丘脑神经细胞损伤过程及详细机制。方法:1.硫堇染色法观察应激刺激对大鼠下丘脑区域的神经细胞的影响。2. 免疫组织化学和Western blot法检测应激刺激对大鼠下丘脑区域GRP78表达的影响。3.免疫组织化学和Western blot法检测应激刺激对大鼠下丘脑区域的PERK-ATF4-CHOP信号通路相关蛋白的表达的影响。4.免疫组织化学和Western blot法检测应激刺激对大鼠下丘脑区域的IRE1α-ASK1-JNK信号通路相关蛋白的表达的影响。5.RNAScope检测应激刺激对大鼠下丘脑区域的CHOP和JNK m RNA表达的影响。结果:1.硫堇染色结果:与对照相比,应激组大鼠出现水肿,神经细胞固缩等病理性改变;而给予GSK2606414和KIRA6处理的应激大鼠上述损伤改变明显减轻。2. 免疫组织化学染色和Western blot结果显示,与对照组相比,stress(P<0.01)、stress+GSK2606414(P<0.01)及stress+KIRA6(P<0.01)组的GRP78表达水平明显增加。3. 免疫组织化学染色和Western blot结果显示,与对照组相比,GSK2606414组的PERK、ATF4、CHOP的表达水平没有显著改变,Stress(P<0.05)和Stress+GSK2606414(P<0.05)组表达水平显著升高,与Stress组相比,Stress+GSK2606414(P<0.05)组表达水平显著降低。4. 免疫组织化学染色和Western blot结果显示,与对照组相比,KIRA6组的IRE1、ASK1、JNK的表达水平没有显著改变,Stress(P<0.05)和Stress+KIRA6(P<0.05)组表达水平显著升高,与Stress组相比,Stress+KIRA6(P<0.05)组表达水平显著降低。5. RNAScope检测结果显示,与对照组相比,GSK2606414组的CHOP m RNA的表达水平没有显著改变,Stress(P<0.05)和Stress+GSK2606414(P<0.05)组表达水平显著升高,与Stress组相比,Stress+GSK2606414(P<0.05)组表达水平显著降低;与对照组相比,KIRA6组的JNK m RNA的表达水平没有显著改变,Stress(P<0.05)和Stress+KIRA6(P<0.05)组表达水平显著升高,与Stress组相比,Stress+KIRA6(P<0.05)组表达水平显著降低。小结:PERK磷酸化抑制剂和IRE1磷酸激酶抑制剂的应用可以显著减轻应激导致的下丘脑神经细胞损伤和变性死亡程度,并显著降低PERK-ATF4-CHOP和IRE1-ASK1-JNK信号通路相关蛋白和m RNA的表达水平,提示PERK-ATF4-CHOP和IRE1-ASK1-JNK信号通路可能参与应激大鼠下丘脑神经细胞损伤过程。第三部分糖皮质激素致PC12细胞损伤的内质网应激机制研究目的:根据第一部分实验结果显示应激大鼠血清GC和GR水平出现动态变化设置,旨在细胞水平探究GC能否导致神经细胞损伤及损伤机制,进一步验证整体实验结论,为应激导致的下丘脑神经细胞损伤以及GC是否参与提供科学依据。方法:1.细胞免疫荧光法检测PC12细胞Map2和GR表达情况。2.CCK-8法检测25μM、50μM、100μM、200μM、400μM地塞米松(Dexamethasone,DEX)对PC12细胞存活率的影响;CCK-8法检测100μM DEX处理PC12细胞24h,36h,48h对细胞存活率的影响。3.细胞免疫荧光法检测DEX对PC12细胞C-fos表达的影响。4.细胞免疫荧光法检测DEX对PC12细胞内质网应激蛋白GRP78、p-PERK、p-IRE1、ATF4、ASK1、CHOP、JNK表达的影响。结果:1.细胞免疫荧光实验结果显示PC12细胞丰富表达Map2和GR。2.CCK-8实验结果显示,与对照组相比,25μM、50μM DEX对细胞存活率没有影响,100μM(P<0.01),200μM(P<0.01)和400μM(P<0.01)组细胞存活率明显降低;与对照组相比,100μM DEX处理细胞24h,36h,48h导致细胞存活率显著降低(P<0.01)。3.细胞免疫荧光实验结果显示,与对照组相比,DEX组C-fos表达明显增高(P<0.01)。4.细胞免疫荧光实验结果显示,与对照组相比,4-PBA组内质网应激蛋白GRP78、p-PERK、p-IRE1、ATF4、ASK1、CHOP、JNK的表达水平没有显著改变,DEX(P<0.05)和DEX+4-PBA(P<0.05)组表达水平显著升高,与DEX组相比,Stress+4-PBA(P<0.05)组表达水平明显降低。小结:丰富表达Map2和GR的PC12细胞适合用于后续GC致神经细胞损伤机制的研究。GC可以抑制PC12细胞的活性,并显著降低细胞存活率,内质网应激PERK-ATF4-CHOP和IRE1-ASK1-JNK通路参与了上述损伤过程。结论:本研究以束缚加冰水游泳应激模型为研究对象,观察应激大鼠行为学改变、应激相关激素及其受体水平变化和下丘脑神经细胞的损伤状态,并应用PERK磷酸化抑制剂GSK2606414和IRE1磷酸激酶抑制剂KIRA6来明确内质网应激在上述损伤中的作用;建立PC12细胞模型,探究PERK-ATF4-CHOP和IRE1-ASK1-JNK通路在GC致PC12细胞损伤中的作用。得出以下结论:1.应激可导致大鼠下丘脑神经细胞出现损伤甚至变性死亡,该损伤可能与GC的水平变化有关。2.内质网应激PERK-ATF4-CHOP和IRE1-ASK1-JNK信号通路可能参与了应激大鼠下丘脑神经细胞损伤过程。3.较高浓度的GC可导致PC12细胞存活率显著降低,内质网应激参与了上述损伤过程。综上,束缚加冰水游泳应激刺激可通过激活内质网应激PERK-ATF4-CHOP和IRE1-ASK1-JNK通路导致下丘脑神经细胞出现损伤甚至死亡,GC及其受体水平变化可能参与了上述损伤过程。