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随着紫杉醇等天然产物在作为抗肿瘤药物方面取得的成功,对天然产物进行结构改造和修饰,以寻找高效、低毒的靶向性药分子,是近年来抗肿瘤药研制的重要途径之一。香豆素类化合物在抗肿瘤药物的研究中有着十分重要的地位。7-羟基-4-甲基香豆素属于天然香豆素,临床上已有羟甲基香豆素片口服药用于治疗胆囊炎、胆石症和胆道感染等疾病,具有抗菌,抗白血病,抗氧化,抗HIV与抗肿瘤等广泛的生物活性。但是天然香豆素存在水溶性差、抗肿瘤活性较弱以及生物利用度低等缺点。哌嗪及其衍生物是一类具有多样的生物活性的化合物,尤其是其具有的抗肿瘤活性以及能作为肿瘤相关蛋白酶抑制剂。本实验以7-羟基-4-甲基香豆素作为母体,根据药物分子拼合原理,在香豆素C-8位引入哌嗪,合成了 22个新的香豆素哌嗪衍生物3a-3p和4a-4o。运用1HNMR、13C NMR和MS等分析测试手段对化合物进行结构表征。用MTT法测试所合成的化合物对HCT-116(人结肠癌细胞),NCI-H460(人大细胞肺癌细胞),MGC-803(人胃癌细胞)等9种癌细胞癌细胞株的体外增殖的抑制作用,以及通过HUVEC(人脐静脉内皮细胞)检测化合物的毒性。实验结果表明大多数香豆素哌嗪衍生物有良好的抗肿瘤能力,绝大部分衍生物的IC50显著低于母体,部分化合物的IC50值低于临床药五氟尿嘧啶,表现出了较强的抗肿瘤活性。以化合物41为代表,我们研究了化合物对NCI-H460细胞株的作用机制。本论文分别利用荧光染色法(Hoechst33258染色和AO/EB荧光染色法)与流式细胞分析(FITC AnnexinV/PI双染)实验,证实了化合物4l主要通过诱导NCI-H460细胞凋亡而抑制该癌细胞生长。采用荧光定量PCR实验,ROS检测实验,检测细胞内钙离子水平以及检测caspase-3酶活性实验对其诱导机制进行了深入研究。荧光定量PCR结果表明,加药后可以显著提高TP53,细胞色素C和AIF的基因水平。此外,41可以激活caspase-3,-8,与-9,提高BAX和BAD-X的基因水平同时降低Bcl-2和Bcl-xL的基因水平。ROS与钙离子检测实验表明,加药后增强了细胞间ROS与钙离子水平。另外,我们还利用流式细胞仪检测了化合物对NCI-H460细胞的细胞周期影响,结果表明化合物41将NCI-H460细胞周期阻滞在G2期。采用Western blot检测经化合物41处理后NCI-H460细胞中caspase-3、caspase-8、cytochrome c、PARP、p53、NF-kb、cyclinB1 与 p21 蛋白水平的表达。实验结果表明,41 上调了 caspase3、cytochromec、cleavg-PARP、p53 与 p21 蛋白的表达水平,而下调了 pro-PARP、pro-caspase 8与Bcl-2的表达水平。因此,我们可以进一步确认化合物41是通过诱导癌细胞凋亡以及阻滞细胞周期在G2期而抑制癌细胞生长。综合以上数据表明,化合物41可能是通过内源性与外源性凋亡信号通路来诱导细胞凋亡,而将NCI-H460细胞阻滞在G2期促进了 41的凋亡诱导作用。总之,通过引入哌嗪提高了 7-羟基-4-甲基香豆素母体的抗肿瘤活性,香豆素哌嗪衍生物具有成为抗肿瘤药物的潜力和广阔的应用前景。