双歧杆菌是非常重要且被广泛认可的益生菌,但是双歧杆菌的制备非常困难,氮源是制约其有效增殖的关键因素之一,且不同种双歧杆菌各自具有特异的氮代谢系统,增加了其培养难度。本课题力求系统探索不同双歧杆菌氮利用的特征,并阐明其与氮代谢基因组的对应关系,以指导双歧杆菌的培养生产及其发酵应用。主要研究结果如下:(1)以长双歧杆菌、短双歧杆菌和两歧双歧杆菌为研究对象,测定其分别利用酵母浸粉、胰蛋白胨、大豆蛋白胨等九种常用发酵氮源生长的最高生物量。结果表明,两歧双歧杆菌对胰蛋白胨利用效率最高,但几乎不利用酵母浸粉类氮源;长双歧杆菌可有效利用除胰酪蛋白胨和牛肉浸粉外的其他氮源;短双歧杆菌在九种氮源下均表现较好的利用效果。高效液相色谱技术对九种氮源的分子量及游离氨基酸成分的检测结果显示,酵母浸粉类氮源中180～2000Da组分含量显著少于其他氮源,且游离的疏水性氨基酸含量为其他氮源2倍;分别采用酪蛋白肽和氨基酸培养双歧杆菌来探究不同双歧杆菌对肽和氨基酸利用效果的差异性,结果表明:两歧双歧杆菌F35、长双歧杆菌CCFM760和短双歧杆菌AH-WH-9M5对肽的利用效率优于氨基酸,且两歧双歧杆菌F35在以肽和氨基酸为氮源下增殖效果的差异性最为显著。(2)在研究得到不同双歧杆菌氮源利用存在差异性基础上,各种属选取代表菌株两歧双歧杆菌F35、长双歧杆菌CCFM760和短双歧杆菌AH-WH-9M5进行基因组测序及注释,对其蛋白和氨基酸代谢相关基因进行比较基因组分析,结果表明:三株双歧杆菌的在氨基酸生物合成能力上不存在差异性,且均无编码细胞壁蛋白酶的基因;编码的肽酶种类及数量在菌株间差异性也相对较小;但长双歧杆菌CCFM760和短双歧杆菌AH-WH-9M5在氨基酸转运蛋白种类以及肽转运系统种类和数量上,较两歧双歧杆菌F35更为丰富,因此对底物的摄取更为广泛。(3)结合基因组学的分析结果,对两歧双歧杆菌F35、长双歧杆菌CCFM760和短双歧杆菌AH-WH-9M5的氨基酸代谢表型做进一步探究。通过单一剔除方法测定不同双歧杆菌的氨基酸营养缺陷型,并剔除合成培养基中疏水性氨基酸来探究其对不同双歧杆菌增殖的影响,结果表明:三株双歧杆菌的氨基酸营养缺陷均表现为半胱氨酸营养缺陷型,但对不同菌株具有生长促进作用的氨基酸种类具有差异性;疏水性氨基酸对于两歧双歧杆菌F35以氨基酸为氮源的增殖具有抑制作用,但在长双歧杆菌CCFM760和短双歧杆菌AH-WH-9M5中不存在该种现象。(4)为进一步研究两歧双歧杆菌F35、长双歧杆菌CCFM760和短双歧杆菌AHWH-9M5肽利用特性,通过蛋白酶解技术制备不同酪蛋白水解物来培养双歧杆菌,并结合超滤、凝胶色谱分离技术对不同水解物进行分离,结果表明:对两歧双歧杆菌F35表现最高生长活性的水解物层析组分其分子量范围介于228～887Da;对长双歧杆菌CCFM760表现最高生长活性的层析组分其分子量介于1535～2280Da;对短双歧杆菌AH-WH-9M5表现最高生长活性的层析组分其分子量介于261～776Da。通过肽转运实验并结合液质测定技术探究肽结构特性,结果表明,可被不同双歧杆菌转运的肽段具有高度的菌株特异性,混合肽组分的促生长活性与组分中的转运肽比率成正比,双歧杆菌对具有亲水性、含促生长作用的氨基酸的肽表现更高的亲和性;两歧双歧杆菌F35最多可转运14肽,且对于2肽、3肽及9肽有着更高的偏好性;长双歧杆菌CCFM760最多可转运含有20个氨基酸的肽段,未检测到对6肽、7肽的转运;短双歧杆菌AH-WH-9M5可转运的肽段主要为2～4肽以及8～20肽,未检测到对5肽、6肽、7肽的摄取。