目的:上皮性卵巢癌（Epithelial Ovarian Cancer,EOC）是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一[1],因缺乏早期诊断方法,五年生存率在30%左右[2-5]。肿瘤细胞减灭术联合以铂类和紫杉醇类为基础的化疗是EOC的标准治疗方法,可大大改善卵巢癌患者的预后[6-10]。但所有铂类药物均能引起严重的不良反应,骨髓抑制是最常见的化疗副反应之一。骨髓抑制严重时可出现继发感染、出血、甚至药物性再生障碍性贫血,是不良预后的危险因素之一。另外,卵巢癌术后化疗耐药和肿瘤复发是卵巢癌治疗中又一棘手问题[11,12]。一半以上患者死于化疗的毒副作用和肿瘤的耐药复发[6,13],因此寻找低毒高效的化疗药物可能成为解决卵巢癌复发和耐药的有效手段,对改善患者预后和提高生活质量有重要的临床意义。倍半萜烯内酯类化合物是从植物中提取的一类天然倍半萜类化合物,广泛存在于菊科、伞形科、大戟科、卫茅科、豆科、葫芦科和毛莨科中,大多具有一定的生物活性,如抗肿瘤、强心、抗疟、抗菌、抗急慢性炎症等[14]。目前对此类物质的研究转向了抗肿瘤和逆转肿瘤耐药方面。Bigelovin属于倍半萜烯内酯类化合物,在菊科植物中含量很高。研究发现bigelovin在体外可抑制人类肺癌、激素依赖性前列腺癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞的生长,且对耐长春碱的上皮性癌细胞系具有很强的细胞毒作用[15-17],国内外关于bigelovin对人上皮性卵巢癌顺铂耐药细胞及正常二倍体细胞的作用尚未见报道。本实验通过体外观察bigelovin对人卵巢浆液性囊腺癌细胞株（SK-OV-3）、人卵巢浆液性囊腺癌顺铂耐药细胞株（SK-OV-3/DDP）和外周血单个核细胞（PBMC）增殖及细胞周期的影响,旨在寻找低毒高效的卵巢癌化疗药物,为克服卵巢癌化疗的毒副反应和耐药提供实验依据,为抗卵巢癌药物的体外筛选提供科学的实验设计思路和实验方法。方法:1体外培养SK-OV-3和SK-OV-3/DDP细胞株:将细胞置于37℃,饱和湿度,5%CO2,含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基中培养,待细胞进入对数生长期时用于实验。2密度梯度离心法分离并培养PBMC细胞:无菌采集正常肘静脉肝素抗凝血,D-PBS溶液等比稀释后,加入淋巴细胞分离液面离心,取中间白膜层洗涤两次,用含20%FBS、2%植物血凝素（PHA）的RPMI-1640培养基培养,台盼蓝排斥试验观察细胞活力。培养24h后,用不含PHA的新鲜培养液接种细胞于96孔板中,静置2h后加药观察。3倒置显微镜观察:用不同浓度bigelovin作用于SK-OV-3、SK-OV-3/DDP和PBMC细胞,在倒置相差显微镜下定时观察细胞的生长情况。4 MTT比色试验法4.1选择不同观察时间细胞的最佳接种密度:观察在含10% FBS的RPMI-1640培养液200μL条件下,分别以1×10⁴/mL、2×10⁴/mL、3×10⁴/mL、4×10⁴/mL、5×10⁴/mL、6×10⁴/mL、7×10⁴/mL、8×10⁴/mL密度接种的SK-OV-3、SK-OV-3/DDP贴壁后24h、48h、72h的生长状况,绘制接种密度-吸光度（OD值）曲线,选择各观察时间细胞的最佳接种密度。4.2选择细胞的最佳接种方式:以8 mg/L顺铂（DDP）作用于SK-OV-3细胞为例,在同一96孔板中接种1.5×10⁴/mL、3×10⁴/mL、6×10⁴/mL三种密度的SK-OV-3细胞,细胞贴壁后每孔加入等量DDP,使终浓度均为8 mg/L。同样方法制备三个96孔板,分别培养24h、48h、72h后,MTT法检测吸光度,比较相同作用时间下,细胞接种密度对DDP抑制率的影响,选择细胞的最佳接种方式。4.3检测药物对细胞增殖的影响:按Table1和Table2所示的实验分组和细胞接种方式,观察bigelovin和DDP对SK-OV-3、SK-OV-3/DDP及PBMC细胞体外增殖的影响,计算药物的半数抑制浓度（IC50）、耐药指数和效能比,评价bigelovin对上皮性卵巢癌细胞的药效。5流式细胞术:碘化丙啶（PI）标记的流式细胞术（FCM）检测bigelovin对SK-OV-3和SK-OV-3/DDP细胞周期的影响。实验分组如下:Bigelovin（0μM、2μM、4μM、8μM）作用于SK-OV-3细胞24h,（0μM、4μM、8μM、16μM）作用于SK-OV-3/DDP细胞72h。6应用SPSS13.0软件进行统计学分析。结果:1倒置显微镜观察:SK-OV-3及SK-OV-3/DDP细胞均呈贴壁生长,SK-OV-3细胞呈梭形,上皮细胞样生长,边界清楚,折光性好。SK-OV-3/DDP细胞呈扁平的多角形,“铺路石”状,边界模糊,折光性差。PBMC呈圆形,大小不均一,体积与SK-OV-3及SK-OV-3/DDP细胞相差较大,静置2h后可轻微贴壁,但不变形。Bigelovin处理SK-OV-3及SK-OV-3/DDP细胞后,细胞密度较对照组低,光泽度下降,出现细胞凋亡特征;Bigelovin处理PBMC细胞24h、48h后细胞变化不大,72h后细胞光泽度下降,细胞数较对照组减少,胞膜皱缩明显。上述细胞凋亡变化随药物浓度和作用时间的增加而逐渐明显。2 MTT法检测结果2.1最佳接种密度:在200μL培养液条件下,SK-OV-3细胞24h、48h、72h的最佳接种密度分别选择6×10⁴/mL、3×10⁴/mL、1.5×10⁴/mL;SK-OV-3/DDP细胞24h、48h、72h的最佳接种密度分别选择8×10⁴/mL、5×10⁴/mL、3×10⁴/mL;PBMC 72h接种密度选择50×10⁴/mL。2.2最佳接种方式:同一观察时间下,细胞以最佳密度接种所得的DDP抑制率,与非最佳细胞密度接种所得的抑制率相比,差异有统计学意义（P<0.05）,接种密度对抑制率有影响;在三个观察时间点最佳接种密度条件下,所得的抑制率标准差均为最小,最佳接种密度下所得的抑制率均数能更好得代表DDP对细胞的抑制作用。故以各时间点细胞的最佳接种密度观察bigelovin和DDP的抑制作用是最佳接种方式。2.3药物对细胞增殖的影响2.3.1 DDP:DDP对SK-OV-3细胞系24h、48h、72h的IC50分别为14.622 mg/L、7.999 mg/L、2.176mg/L;对SK-OV-3/DDP细胞系24h、48h、72h的IC50分别为23.375 mg/L、13.695 mg/L、4.899mg/L ,对PBMC细胞72h的IC50为14.922 mg/L。SK-OV-3/DDP细胞系的DDP平均耐药指数为1.854,小于建株者提供的耐药指数。DDP作用72h对SK-OV-3细胞的效能比为6.858,对SK-OV-3/DDP细胞的效能比为3.046。在一定时间和浓度范围内,DDP对卵巢癌细胞抑制作用存在时间-剂量依赖性,对正常二倍体细胞生长的抑制作用存在剂量依赖性。2.3.2 Bigelovin:Bigelovin对SK-OV-3细胞24h、48h、72h的IC50分别为6.643μM、2.176μM、0.940μM;对SK-OV-3/DDP细胞的IC50分别为70.352μM、44.573μM、15.933μM;对PBMC细胞72h的IC50为21.933μM。Bigelovin对SK-OV-3/DDP细胞24h、48h时IC50大于其体外药效评价标准32.895μM,故仅作用72h评价为有效。SK-OV-3/DDP细胞系对bigelovin的耐药指数为16.950,是DDP耐药指数的8.634倍;Bigelovin作用72h对SK-OV-3细胞的效能比为23.333,对SK-OV-3/DDP细胞的效能比为1.377。在一定时间和浓度范围内,bigelovin对DDP敏感卵巢癌细胞抑制作用存在时间-剂量依赖性,对DDP耐药上皮性卵巢癌细胞和正常细胞的抑制作用存在剂量依赖性。3 FCM检测显示:Bigelovin可将SK-OV-3和SK-OV-3/DDP细胞阻滞于G₂/M期,且G₂/M期和S+G₂/M期细胞比例随药物浓度的升高而升高。结论:1用MTT比色法进行体外抗癌药物筛选时,接种密度对药物的抑制率有影响,应选择各时间点细胞的最佳接种密度观察药物的抑制作用;2卵巢癌体外抗癌药物筛选不应选择正常卵巢上皮细胞或正常子宫内膜细胞作为二倍体对照,外周血单个核细胞是一个较理想的选择;3 Bigelovin对DDP敏感型上皮性卵巢癌（EOC）细胞株的选择性抑制作用优于DDP,可进一步做体内实验,以明确其对DDP敏感型EOC的治疗作用;4 Bigelovin对DDP耐药型EOC细胞株的抑制作用较差,与DDP存在交叉耐药,不宜单独用于DDP耐药EOC的治疗;5 Bigelovin可将SK-OV-3和SK-OV-3/DDP细胞系阻滞于G2/M期,可能是bigelovin抑制EOC细胞增殖的潜在机制;6 Bigelovin可能是潜在的化疗增敏剂。