背景新型冠状病毒肺炎（Coronavirus disease 2019,COVID-2019）疫情,自2019年底出现以来,对全球公共健康和社会运转造成严重影响,也给我国疫情防控带来巨大压力。早发现早防治是切断传播途径的主要手段。新冠抗原检测作为重要的辅助性直接检测手段具有样本处理简单,检测便捷等优势。刺突（S）蛋白在受体识别和细胞膜融合中发挥着关键作用,是疫苗研制、诊断试剂和治疗性抗体研发的重要靶点。为更好地做好疫情后期防控工作,建立一种针对S蛋白的新冠抗原快速检测方法对新冠（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2）感染早期诊断尤为重要。目的本研究通过原核表达系统制备RBD重组蛋白,利用小鼠杂交瘤技术筛选并鉴定出抗RBD配对单克隆抗体,基于配对抗体建立一种新型冠状病毒抗原胶体金免疫层析检测方法。方法1.RBD重组蛋白的制备:构建含RBD核酸序列的重组表达载体,将其转入BL21（DE3）表达菌进行诱导和表达,通过SDS-PAGE分析其表达情况,并对其表达条件进行探究;并利用Western Blot对其进行鉴定;采用Ni-NTA进行纯化,梯度浓度透析后得到复性的RBD重组蛋白。2.新型冠状病毒RBD单克隆抗体制备:利用RBD重组蛋白进行BALB/c小鼠免疫,待其抗血清效价达到要求后加强免疫,加强免疫3天后取其脾细胞与骨髓瘤SP2/0进行融合;通过ELISA筛选的阳性单克隆杂交瘤细胞进行小鼠腹腔注射,获得的腹水采用辛酸-硫酸铵方法进行纯化;利用SDS-PAGE对单克隆抗体的纯度进行鉴定、Western Blot鉴定其与RBD重组蛋白的反应性后,通过ELISA检测其效价、亲和力和配对情况。3.新型冠状病毒抗原胶体金免疫层析检测方法的建立（双抗体夹心法）及性能评价:采用胶体金对RBD单克隆抗体进行标记,以硝酸纤维素膜为载体对另一配对RBD单克隆抗体进行包被制备试纸条;并对试纸条的最低检测范围、稳定性、特异性等性能进行评价。结果1.成功构建pET-28a-RBD重组表达载体,采用原核表达系统对其进行诱导表达,通过不同表达条件的探究,RBD蛋白始终以包涵体形式表达,其最优条件为37℃,0.4mmol/L IPTG,诱导表达6 h。重组包涵体蛋白在8 M尿素变性条件下利用Ni-NTA进行纯化,得到大小约27 kDa,纯度为90%的重组蛋白。在5%SLS、5%甘油条件下,通过梯度透析缓慢减低变性剂浓度,60%的纯化蛋白能够复性。2.重组RBD蛋白免疫小鼠后利用杂交瘤技术得到6株单克隆抗体,6株单克隆抗体效价均达到2×10~5以上。Western blot验证结果表明,获得的6株单克隆抗体均能特异性识别重组RBD蛋白。通过间接ELISA对6株单克隆抗体的亲和力常数进行测定,6株单克隆抗体亲和力常数均大于1.0×10~8L/mol,均具有高亲和力。通过单抗配对实验,筛选到1C5和2E11细胞株为配对抗体。3.初步建立了新型冠状病毒抗原胶体金免疫层析检测方法,其最低检测浓度为250pg/mL;能够特异性与重组RBD抗原结合,不与甲乙流感病毒等4种呼吸道病毒反应;在37℃加速破坏20天条件下,仍可以检测重组抗原T线显色无明显变化,其稳定性良好。结论1.成功制备SARS-CoV-2 RBD重组蛋白并确定其最优诱导表达条件。2.利用杂交瘤技术制备出6株RBD单克隆抗体,并筛选出一对可用于新型冠状病毒抗原胶体金免疫层析检测方法的配对抗体。3.初步建立了一种新型冠状病毒抗原胶体金免疫层析快速检测方法。