复杂性状的系统遗传学研究中,分析差异表达基因,可从中获取基因转录,基因调控,信号转导通路及其相互联系等相关信息;进而揭示基因在时间、空间上的表达模式。常用的技术有传统的竞争性PCR、实时荧光定量PCR、基因芯片表达谱以及近年来蓬勃发展的基于二代测序平台的各种基因表达分析技术等,研究者常常根据具体实验需求而选取适当的技术。本研究结合多重竞争性PCR和Ion proton二代测序平台,开发了一种针对大样本量的目的基因差异表达分析方案,并应用于野生来源1号染色体小鼠血脂调控相关系统遗传学研究中,为小鼠血脂异常这一复杂性状研究提供了丰富的基因表达数据。基于二代测序的多重竞争性PCR技术包含如下关键点:1)竞争性模板的构建,采用单碱基突变的特异性逆转录引物,通过逆转录反应快捷制备竞争性模板;2)PCR扩增效率标准曲线,竞争性内参模板和目标模板以不同比例梯度混合,通过标准曲线校正引物实际扩增效率带来的定量偏差;3)多重PCR均一性的调整,针对同管反应不同的扩增子,调整特异性引物浓度比例,采用实时荧光定量PCR方式进行定量,每个产物对应一个通用性上游引物和一个特异性下游引物,从而保证多个扩增子间的均一性;4)Ion proton平台测序,基于该平台的数据特点,本研究开发了一套匹配检测基因、分离不同的竞争性模板和reads数目统计分析的完整流程,可快速准确统计结果。首先用8个基因作为小试,对该技术方案的可行性进行评估,结果显示:1)标准曲线拟合度系数R2均大于0.98,优于real-time PCR的拟合度(0.97-0.99),可更精确的校正引物扩增效率偏差;2)计算3个实验重复的标准方差SD表明,该方案和real-time PCR具有相同的稳定性(SD<0.05);3)检测2倍基因表达差异能力,该方案和real-time PCR结果有良好的一致性(R2>0.98),证明该方案优秀的灵敏度和准确度。基于上述结果,将该方案应用于172个小鼠样本113个基因差异表达分析中,发现在不同品系中的小鼠检测基因有显著的表达差异,提示转录水平的差异可能与血脂水平差异相关,为本课题组今后的系统遗传学研究奠定了数据基础;同时,检测113个扩增子的均一性,90%以上reads差异在30倍以内,解决了扩增子测序中过量测序(over-sequencing)和低表达转录本测序深度不足的难题,将目标片段测序成本大大降低。本研究建立的基于二代测序的多重竞争性PCR技术,具有优秀的稳定性,高灵敏度和高准确度,在小鼠血脂调控相关系统遗传学研究中的应用证明了其低廉的成本,以及快捷的后续数据分析。在今后复杂性状疾病的系统遗传学研究中,基于二代测序的多重竞争性PCR一定可以成为众多研究者的热门选择技术。