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α-L-鼠李糖苷酶能特异性水解末端含α-L-鼠李糖的物质。天然黄酮类物质芦丁可在α-L-1,6-鼠李糖苷酶的作用下生成异槲皮苷与L-鼠李糖,异槲皮苷又能被β-D-葡萄糖苷酶水解成槲皮素。本论文从黑曲霉WZ001(Aspergillus niger WZ001)中分离得到α-L-1,2-鼠李糖苷酶、α-L-1,6-鼠李糖苷酶与β-D-葡萄糖苷酶三种糖苷酶,对其中的α-L-1,6-鼠李糖苷酶与β-D-葡萄糖苷酶进行酶学性质研究以应用于芦丁催化中。为了深入探究糖苷酶的结构特性、实现α-L-鼠李糖苷酶的工业化生产,本论文将α-L-1,6-鼠李糖苷酶基因在毕赤酵母(Pichiα apstoris)中重组表达。1.利用超滤、盐析、疏水层析、阴离子交换层析、凝胶过滤这五种蛋白质纯化方式,分离得到A.niger WZ001中的三种糖苷酶,并对各纯酶进行N端测序。α-L-1,2-鼠李糖苷酶纯化倍数为27.2,纯化得率为9.4%,其亚基分子量为106 kDa;纯酶酶活力为49 U/mg,蛋白质N端封闭,无法测得序列。α-L-1,6-鼠李糖苷酶纯纯化倍数为36.0,纯化得率为9.2%,其亚基分子量为66 kDα;酶酶活力为79.1 U/mg,N端序列为ETISLPQTDKWWTNY。β-D-葡萄糖苷酶纯化倍数为40.4,纯化得率为2.7%,其亚基分子量为120 kDα;纯酶酶活力为113.1 U/mg,N端序列为 DELAYSPPYYPSPWA。2.对α-L-1,6-鼠李糖苷酶与β-D-葡萄糖苷酶的酶学性质进行研究,以作为这两个酶在芦丁催化应用中的基础。α-L-1,6-鼠李糖苷酶的最适温度为65℃,最适pH范围为4.0-5.0。α-L-1,6-鼠李糖苷酶能耐受高浓度有机溶剂,在甲醇浓度为40%还保有初始酶活的66.9%。α-L-1,6-鼠李糖苷酶在2 mM的金属离子存在时酶活都降低,添加EDTA时酶活不受影响。对α-L-1,6-鼠李糖苷酶的温度稳定性研究结果表明,该酶在55℃与60℃时温度稳定性较好,在保温2 h后,酶活为初始酶活的95%。β-D-葡萄糖苷酶的最适温度为60℃,最适pH为3.0。在甲醇浓度为40%时,β-D-葡萄糖苷酶的酶活为初始酶活的27.8%。β-D-葡萄糖苷酶在2 mMAl3+存在时,酶活提高至初始酶活的132%,添加EDTA后酶活下降。优化了酶法水解芦丁的工艺条件:底物芦丁浓度为15%,温度60℃,pH 4.5,搅拌转速200 rpm;反应不添加助溶剂。α-L-1,6-鼠李糖苷酶单酶催化反应48 h,15%芦丁完全转化为异槲皮苷。α-L-1,6-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶双酶协同催化72 h,15%芦丁完全转化为槲皮素。此外,建立了芦丁水解产物的分离工艺,得到的异槲皮苷、槲皮素、L-鼠李糖纯度均可达98%以上。3.黑曲霉WZ001的α-L-1,6-鼠李糖苷酶编码基因长为1317 bp(含终止子TGA),编码438个氨基酸。该氨基酸序列与序列号为AM269971.1的鼠李糖苷酶同源序列相比,其N端缺少201个氨基酸(不含信号肽),其余部分则两者完全—致,表明该酶是一个新型的鼠李糖苷酶。将密码子优化后的两个不同基因(包含缺失的201个氨基酸的完整序列rhaY、不含缺失序列的rhaNY)重组于酵母分泌型表达质粒pPICZα中,将线性化的重组质粒转化于毕赤酵母表达系统,成功构建了两个毕赤酵母重组基因工程菌,为深入研究rhaNY缺失序列的作用、实现α-L-1,6-鼠李糖苷酶工业的工业化应用奠定基础。