【摘 要】
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塞内卡病毒A（Senecavirus A,SVA）是小RNA病毒科塞内卡属的唯一成员,能够引起猪严重的水疱病和新生仔猪死亡,对全世界养殖业造成巨大损失。SVA感染引发的水疱病变与口蹄疫（foot-and-mouth disease,FMD）、猪水疱病（swine vesicular disease,SVD）、猪水疱疹（vesicular exanthema of swine,VES）和水疱性口炎（
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塞内卡病毒A（Senecavirus A,SVA）是小RNA病毒科塞内卡属的唯一成员,能够引起猪严重的水疱病和新生仔猪死亡,对全世界养殖业造成巨大损失。SVA感染引发的水疱病变与口蹄疫（foot-and-mouth disease,FMD）、猪水疱病（swine vesicular disease,SVD）、猪水疱疹（vesicular exanthema of swine,VES）和水疱性口炎（vesicular stomatitis,VS）引起的病变极为类似。2015年,我国广东省首次报道了SVA疫情,随后波及福建、湖南、河南、黑龙江等省份,目前疫情已蔓延至绝大数省份,严重危害国内养猪业。鉴于SVA快速传播的能力,建立高效、准确的检测方法和研制SVA疫苗是进行该病防控的关键。基于此,本论文从开展了以下研究:1.SVA分离鉴定。通过PCR对猪场采集的病料进行检测后,利用猪肾细胞（porcine kidney,PK-15）进行病毒培养和分离,通过细胞病变观察、全基因组扩增、电镜观察和系统进化树对细胞培养物中的病原体进行鉴定。结果表明通过PK-15细胞成功分离到一株SVA（CH-HNZK-2017）。遗传分析显示,CH-HNZK-2017和US-15-40381IA之间的核苷酸序列同源性最高（98.6%）,而与SVV-001之间的基因组同源性最低（93.7%）。基于SVA全基因组序列构建系统进化树,表明CH-HNZK-2017位于Senecavirus病毒属,且与US-15-40381IA亲缘关系最近。2.SVA RPA-LFD检测方法的建立。利用重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification,RPA）和侧向流试纸条（Lateral Flow Dipstick,LFD）,设计了基于SVA的结构蛋白1（Viral structural protein 1,VP1）基因保守区的引物和探针,并进行筛选、反应条件优化以及敏感性和特异性试验,建立了RPALFD方法,并对该方法进行临床样本检测。结果表明RPA-LFD的最佳反应条件在35℃下作用25 min,并将结果直接显示在试纸条上。特异性试验显示与其他病毒无交叉反应,敏感性试验显示最低检测限为15 copies/μL。RPA-LFD和q RTPCR在检测临床样品符合率100%。3.基于SVA VP2的免疫原性研究。以SVA-CH-HNZK-2017分离株c DNA为模板,PCR扩增VP2基因,并构建重组质粒p ET-30a-VP2。经鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌进行诱导表达。将纯化后的重组蛋白与206佐剂乳化后制备成疫苗,免疫猪来评价疫苗效果。原核表达结果显示,成功表达了VP2蛋白,且主要以可溶性表达。Western blot结果显示,重组蛋白VP2表现出良好的反应原性。成功制备了基于VP2蛋白的SVA亚单位疫苗,该疫苗均能显著性提高特异性抗体、IL-4和IFN-γ的表达水平（P＜0.01）。攻毒保护试验表明,VP2亚单位疫苗组对SVA攻击提供了4/5保护,而佐剂组和PBS对照组则无保护作用。综上所述,本试验成功分离到一株SVA流行毒株,为该病毒的深入研究奠定了基础。本研究所建立的RPA-LFD检测方法可作为SVA现场诊断的一种潜在的快速、可靠、灵敏和低成本方法,尤其是在资源有限的地区。本研究研制的VP2亚单位疫苗具有良好的免疫保护效果,为研发SVA新型疫苗提供新的方向。
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