研究背景与目的：心脏具有生成ATP的巨大潜能以满足对能量的高度需求。在胚胎时期及心肌肥大发生时,心脏主要依赖葡萄糖和乳糖作为底物产生ATP,而在出生后及成人心脏则主要依赖脂肪酸作为底物产生ATP而获得能量。由于心肌的脂质和葡萄糖储存能力有限,因此,它们作为底物的选择及ATP的生成是受到快速调节的,以迅速适应心脏的能量需求。这一调节过程涉及到多种基因不同时间的先后表达和相互作用,它们形成一个有序的网络。该调节网络包括大量的,在时间和空间上极为精确的一系列分子事件。在这个过程中,哪怕是极微小的错误都将导致心肌能量代谢障碍的发生,而心肌能量代谢障碍,如线粒体脂肪酸氧化活性的降低,造成ATP产量减少,将会导致心泵功能、收缩功能及钙离子的转运功能等失调,从而诱发心肌肥大和心力衰竭等。因此,深入研究心肌能量代谢关键基因的调控机制,将有助于从分子水平阐明心血管疾病的分子机理和病理学基础,同时也可为心血管疾病的临床防治和新药设计提供更多线索。那么,涉及心肌能量代谢的关键基因有什么呢?Glut4是调节心肌能量代谢的一个基因,它是葡萄糖转运蛋白家族的成员,维持着机体葡萄糖的内稳态平衡。Glut4的表达具有组织特异性并受到激素调节,Glut4基因敲除小鼠出现心肌肥大症状。因此,GIut4是调节心肌能量代谢的关键基因之一。鉴于此,GIut4作为心肌能量代谢的关键基因,其表达的降低或上调,对于心肌能量代谢的调节具有重要的生理或病理意义,所以研究其调控机制,是心血管分子生物学领域的重要课题。那么,参与心肌能量代谢的转录因子有哪些呢?过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptors, PPARs)是调节编码脂肪酸β-氧化相关酶类基因的重要转录因子,它包含三种异形体：PPARa、PPARγ和PPARδ/1β。这三种异形体都在心脏中表达,与PPARy相比,PPARa和PPARδ/β在心肌细胞中的表达更为丰富。研究表明,心脏特异性过表达PPARa将诱导与脂肪酸利用有关的基因表达,进而增强心脏脂肪酸的利用和氧化；PPARδ/β基因敲除小鼠严重地损害心肌脂肪酸氧化相关基因的表达,增加心脏脂肪酸堆积,从而诱发脂毒性。因此,PPARs在调节心肌能量代谢中发挥着重要作用。GATA蛋白是具有锌指结构的转录因子,因其识别序列(A/T) GATA (A/G)而得名。在该家族6个成员中,GATA4和GATA6是近年来心血管领域的研究热点。大量的研究证明GATA4和GATA6是调控心脏发育以及心肌细胞增殖、分化和凋亡的重要转录因子。但它们是否在心肌能量代谢中发挥调控作用,目前知之甚少。MicroRNAs (miRNAs)是进化上高度保守的内源性单链非编码小RNA,通过转录后机制调控靶基因的表达。近年来的研究表明miRNAs是心脏基因转录调控网络的一个重要组成部分,但miRNAs是否作用于GATA蛋白与PPARs,进而对细胞的表型产生影响,目前还鲜有报道。因此,本课题以GATA转录因子为中心,采用多种方法深入研究了GATA6、 PPARa、miR-200b以及GATA4对心肌能量代谢和细胞增殖的调控机制。研究方法与结果：第一部分：转录因子GATA6招募PPARa协同激活GIut4基因的表达为进一步了解GATA家族对心肌能量代谢的调控作用,采用了瞬时转染、Q-PCR、荧光素酶报告基因、Western Blot、CoIP、GST pull-down和ChIP等实验方法,证实了在PPARa激动剂fenofibrate刺激的心肌细胞中,转录因子GATA6能够招募核受体PPARa至葡萄糖转运蛋白GIut4启动子的GATA元件上,这种招募能够进一步激活Glut4基因的表达,并且伴随着线粒体功能的促进及葡萄糖利用的增加。Western Blot及Q-PCR实验显示GATA6或PPARa及其激动剂fenofibrate都能够刺激Glut4基因的表达,若二者共表达则可以产生更强烈的激活效应,说明GATA6和PPARa协同激活Glut4基因转录。CoIP实验证实GATA6和PPARa相互作用。GST pull-down实验显示GATA6的C端锌指和PPARa的N端锌指介导二者间的相互作用。ChIP及荧光素酶报告基因实验进一步证实GATA6通过与PPARa蛋白的N端TAD和锌指结构域相互作用,招募PPARa至Glut4启动子从而协同激活Glut4基因的表达,促进线粒体的功能及葡萄糖的利用。该部分的研究证实了转录因子GATA6是心肌能量代谢的重要调节因子,核受体PPARa是GATA6调节基因转录过程中新的相互作用因子,这为理解GATA6在心脏发育和心脏疾病的作用机制提供了新的分子基础。第二部分：fenofibrate和Dox对小鼠NADH氧化酶及柠檬酸脱氢酶活性的影响多柔比星(doxorubicin, Dox)是一种常用的抗肿瘤药物,由于它的严重毒性大大限制了它的临床使用。线粒体功能障碍是其潜在的致毒机制之一,但具体机制未知。由于在第一部分研究中观察到PPARa对细胞线粒体功能具有保护作用,所以我们进一步研究了PPARa激动剂fenofibrate在体内能否保护线粒体功能并逆转Dox的毒性。将8周大的小鼠随机分为四组并给予不同的处理：对照组：每天0.5%羧甲基纤维素钠灌胃一次,连续14天；fenofibrate处理组：每天fenofibrate(100mg/kg)灌胃一次,连续14天；Dox处理组：第12、13和14天,每天腹腔注射Dox(15mg/kg)一次；联合组：同时接受fenofibrate和Dox处理。14天后处死小鼠,分离提取心室、心房、肝脏、肾脏、肺和脾脏组织的线粒体,检测线粒体功能的标志酶柠檬酸合酶及NADH氧化酶活性。结果显示：fenofibrate可在多个组织中保护线粒体功能,相反,Dox则在多数组织中抑制线粒体的功能,而且,fenofibrate在心室和肾脏中能够逆转Dox的毒性。这一研究证实fenofibrate对线粒体柠檬酸合酶和NADH氧化酶具有保护作用,并且在心室和肾脏中能够逆转Dox的毒性作用,为临床上如何减轻Dox的化疗副作用提供了理论依据。第三部分：miR-200b作用于GATA4对细胞增殖、周期和凋亡的调控为了寻找GATA家族的上游调控分子,经生物信息学分析,发现GATA4可能是miR-200b的靶基因。miR-200b参与调控上皮间质转化(EMT)过程,是肿瘤细胞形成的重要调控因子。由于miRNAs调控细胞增殖、分化和凋亡等多个生理学和病理学过程,因此,我们采用稳定转染、RNAi、荧光素酶报告基因、MTT、流式细胞术、DAPI染色RT-qPCR等实验方法研究了miR-200b对细胞增殖、周期和凋亡的影响。结果显示：过表达GATA4和rniR-200b分别促进和抑制C2C12及P19细胞的增殖。而且,过表达(?)niR-200b及siRNA抑制GATA4表达均诱导细胞发生G0/G1期阻滞,S期和G2/M期细胞百分比降低。DAPI染色证实miR-200b过表达还能诱导细胞核发生凋亡。荧光素酶报告基因实验表明miR-200b可与GATA43’非翻译区(3’-UTR)特异性结合。Western Blot实验进一步验证了miR-200b可以在蛋白水平上抑制GATA4的表达,表明GATA4确系：-niR-200b的靶基因。该研究证实了GATA4是miR-200b的靶基因,miR-200b通过转录后机制调控GATA4的蛋白表达,进而抑制细胞的增殖,致使细胞发生G0/G1期阻滞,并诱导细胞发生凋亡。这些结果表明miR-200b可能通过靶向GATA4在心脏发育、增殖与凋亡等方面发挥重要的调控作用。结论：1、在PPARa激动剂fenofibrate刺激的心肌细胞中,转录因子GATA6招募核受体PPARa至葡萄糖转运蛋白Glut4启动子的GATA元件上,这种招募能够进一步激活Glut4的表达,并且伴随着线粒体功能的促进及葡萄糖利用的增加。2、PPARa激动剂fenofibrate对线粒体柠檬酸合酶和NADH氧化酶具有保护作用,可减轻抗癌药物Dox诱导的心、肾毒性。3、miR-200b作用于转录因子GATA4,抑制C2C12细胞和P19细胞的增殖,致使细胞发生G1/GO期阻滞并诱导细胞凋亡。本研究证实了GATA6是心肌能量代谢调控网络中的重要组成成分,并且作为PPARα的辅助激活因子协同PPARα调控心肌能量代谢。这为理解GATA6在心脏发育和心脏疾病的作用机制提供了新的分子基础。这一研究还揭示了miR-200b在细胞增殖与凋亡中的作用机制,为进一步理解GATA家族转录因子在心肌中的调控作用奠定了基础。