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α-地中海贫血是一种常染色体单基因遗传病,是一种由基因突变导致珠蛋白结构异常、血红蛋白(hemoglobin,Hb)组成成分异常的慢性溶血性贫血。东南亚型(southeast Asia,SEA型)地中海贫血是α-地中海贫血中占比最多的类型,其遗传学特征为一条染色体上两个拷贝的α-珠蛋白基因均缺失。Hb Bart’s胎儿水肿综合征是α-地中海贫血中严重的致死性疾病。当夫妻双方均为SEA型α-地中海贫血患者时,怀孕后的胎儿则存在25%的概率为Hb Bart’s胎儿水肿综合征,不仅导致胎儿无法存活,还对孕妇的生命具有较大威胁。因此应加强对SEA型α-地中海贫血的检测以及其胎儿的产前检测。针对SEA型α-地中海贫血早期的检测方法包括全血细胞计数,高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)以及血红蛋白电泳。近30年来,多种分子遗传学检测方法,如DNA印迹杂交和DNA测序可以准确地检测大多数α-珠蛋白基因的变异,从而诊断α-地中海贫血。然而,这些方法由于操作繁琐且成本昂贵,不适用于进行所有α-地中海贫血病例的诊断。快速的筛查方法如跨越断裂点的PCR技术(gap-PCR)现已广泛应用于7种常见的缺失型α-地中海贫血的检测。实验室为了保证检测结果的准确性,在日常检测前需对商品化试剂进行性能验证(verification),厂家在进行方法研发时,需采用阳性样本进行性能确认(validation)。实验室在日常检测中,要进行室内质量控制(internal quality control,IQC)、参加室间质量评价(external quality assessment,EQA)/能力验证(proficiency testing,PT),而这些过程都离不开质控品。通常的遗传病检测质控品可分为以下三类:第一,非细胞类质控品,如人工合成的质粒;第二,采用患者细胞构建的永生化细胞系;第三,通过基因编辑技术在正常细胞系的基础上导入目的突变获得的细胞系。但是前两种类型的质控品存在一定的局限性,如非细胞类质控品缺乏细胞基因组DNA(genomic DNA,gDNA)的提取过程;永生化的患者细胞类质控品,其所包含的突变类型较少。而通过基因编辑技术制备的质控品,不但能包含更多的突变类型,也能模拟真实样本。目前,已有研究将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于质控品的制备,但是这些研究采用的细胞系均为贴壁细胞系,尚无采用淋巴母样细胞系进行质控品制备的研究,而国际公认母亲/父亲/儿子正常家系(CEPH/UTAHPEDIGREE 1463亲子细胞系GM12878/GM12877/GM12884)中的细胞系多为淋巴母样细胞系。因此,采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对淋巴母样细胞系进行突变细胞系的构建有利于在国际公认亲子细胞系中构建同种类型的突变,从而不仅可以制备出针对SEA型α-地中海贫血检测的质控品,而且可以通过亲子细胞系的配对和酶消化的方法产生匹配的母体和胎儿游离DNA(cell free DNA,fDNA),从而可以为今后α-地中海贫血无创产前检测质控品的制备打下基础。本研究中,我们以稳定表达Cas9蛋白的GM12878细胞系为基础细胞系,根据SEA型α-地中海贫血基因突变中16号染色体上存在19kb的DNA片段缺失的特点,针对其在16号染色体上缺失片段的两个断裂位点设计两种不同的单链引导RNA(singleguide RNA,sgRNA),并在体外通过pX458重组质粒对sgRNA进行转录和纯化,将纯化好的sgRNA通过电转染的方式导入稳定表达Cas9蛋白的GM12878细胞系中,以制备具有SEA型α-地中海贫血基因突变的细胞系。我们同时也进行了直接转染pX458重组质粒(可表达Cas蛋白和sgRNA)至普通的GM12878细胞系的研究,并比较了二者的编辑效率。对最终编辑成功的细胞系进行了gap-PCR验证、Sanger测序验证以及全基因组测序(whole genome sequencing,WGS)验证。结果显示将体外转录纯化后的sgRNA经电转染至稳定表达Cas9蛋白的GM12878细胞系相对于直接电转染pX458重组质粒至普通的GM12878细胞系是一种更有效的基因编辑方式。编辑后的单克隆细胞经gap-PCR验证的电泳结果显示在预期位置出现了电泳条带,即与SEA型α-地中海贫血的电泳条带位置相同。gap-PCR验证阳性的单克隆细胞PCR扩增产物经Sanger测序验证结果表明,在16号染色体上形成了 19kb左右的缺失突变,与SEA型α-地中海贫血基因突变缺失位置相同。但是在断裂位点处存在1 0bp左右的短片段插入或缺失突变(insertion and deletion,InDel),这相比于SEA型α-地中海贫血基因突变中近19kb的DNA片段缺失,可忽略不计。全基因组测序的分析结果也显示与SEA型α-地中海贫血基因突变相一致。综上所述,我们通过将体外转录获得的sgRNA经电转染至稳定表达Cas9蛋白的GM12878细胞系,制备了含有SEA型α-地中海贫血突变的细胞系,并采用不同方法进行验证。结果表明该方法是一种较为有效的基因编辑方式。同时不同方法的验证结果也表明经过基因编辑后的含有SEA型α-地中海贫血突变的GM12878细胞系可以作为SEA型α-地中海贫血检测的质控品。本研究的创新性在于:(1)首次采用基于电转染的方式将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于遗传病检测的质控品制备中。(2)本研究使用的细胞系为国际公认的正常家系中母亲来源的细胞系,可采用同样的方法在正常家系中胎儿来源的细胞系中构建相同类型的突变,从而可以为制备α-地中海贫血的无创产前检测质控品提供物质基础,这也是本研究下一阶段考虑的研究内容。